靶向肌成纤维细胞铜脆弱性：通过METTL3导向的STAT6 m6A甲基化驱动铜死亡(cuproptosis)逆转肺纤维化

《Journal of Advanced Research》：Targeting myofibroblast copper vulnerability reverses pulmonary fibrosis via METTL3-directed STAT6 m6A driving cuproptosis

摘要：特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)因抗凋亡的肌成纤维细胞(myofibroblast)驱动病理性细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积仍是一种致命性疾病，现有疗法无法直清除这些细胞，而铜死亡(cuproptosis)——一种铜依赖的细胞死亡途径——在肺纤维化中尚未被探索。本研究旨在探讨铜离子载体(copper ionophore)是否通过cuproptosis诱导选择性肌成纤维细胞死亡及其抗纤维化效应，并进一步阐明涉及信号转导和转录激活因子6(signal transducer and activator of transcription 6, STAT6) m6A甲基化的分子机制。研究人员对博来霉素(bleomycin, BLM)诱导的纤维化小鼠给予铜离子载体以评估其抗纤维化作用及cuproptosis诱导情况，分离原代肺成纤维细胞进行体外分析，采用STAT6成纤维细胞条件性敲除(conditional knockout, cKO)小鼠及针对METTL3和IGF2BP2的过表达与敲低研究探索潜在机制。研究结果显示铜离子载体显著减少小鼠肺胶原沉积并清除α-SMA+肌成纤维细胞。机制上，铜离子载体抑制成纤维细胞中METTL3介导的m6A甲基化，导致STAT6 mRNA去稳定及m6A修饰信号减弱，进而废除STAT6对铜稳态的调控——通过下调ATP7A削弱铜外流，并破坏STAT6-Nrf2-FDX1轴致有毒Cu+蓄积。结论：铜离子载体诱导cuproptosis选择性清除肌成纤维细胞从而逆转肺纤维化，METTL3-STAT6-Nrf2轴被鉴定为可成药检查点(checkpoint)，确立铜离子载体作为IPF新型治疗手段。

论文解读

本文发表于《Journal of Advanced Research》，研究背景如下：特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种以肺泡破坏和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积为特征的致死性间质性肺病，核心病理是成纤维细胞异常活化为抗凋亡的肌成纤维细胞（myofibroblast），驱动ECM合成与组织重构。目前临床抗纤维化药物仅能适度延缓病程，无法选择性清除活化肌成纤维细胞。铜是维持线粒体呼吸和抗氧化防御的氧化还原活性金属，近期发现的铜死亡（cuproptosis）是由过量铜诱导含硫簇蛋白失稳及脂酰化蛋白（如DLAT）聚集引发的调节性细胞死亡，在肿瘤中有报道但在纤维化中未被研究。纤维化组织存在铜稳态改变，提示活化成纤维细胞可能存在铜依赖性脆弱性。N6-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine, m⁶A）是最丰富的真核mRNA内部修饰，调控RNA稳定性与翻译，m⁶A写入酶METTL3及阅读蛋白IGF2BP2参与多种疾病进程，但与STAT6信号及铜代谢的关系在成纤维细胞中未知。STAT6系Th2免疫及纤维化ECM合成的关键转录因子，可调控线粒体功能和抗氧化反应，其下游Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）被报道可转录抑制铜还原酶FDX1（ferredoxin-1，将Cu²⁺还原为Cu⁺的关键分子），因此STAT6–Nrf2–FDX1轴可能与铜毒性调控有关。基于此，研究人员假设铜离子载体可通过诱导活化肌成纤维细胞cuproptosis逆转肺纤维化，并受METTL3–STAT6–m⁶A–铜稳态轴调控。

主要关键技术方法：采用C57BL/6小鼠构建博来霉素（bleomycin, BLM）气管滴注诱导肺纤维化模型，成纤维细胞特异性Stat6敲除（Stat6 cKO）小鼠由Col1a2-CreER与Stat6^flox/flox杂交获得；给予三种铜离子载体——Elesclomol（ES）、Disulfiram（Dis）、NSC319726（NSC）干预，铜螯合剂Tetrathiomolybdate（TTM）作挽救实验；经尾静脉注射AAV9-METTL3或对照干预METTL3过表达小鼠；分离原代肺成纤维细胞行TGFβ1活化及铜离子载体处理，辅以siRNA敲低STAT6/Nrf2及过表达METTL3/IGF2BP2/STAT6；采用HE、Masson三色、天狼猩红染色评估肺组织纤维化程度，免疫组化（IHC）与免疫荧光（IF）检测α-SMA、DLAT寡聚化、p-STAT6等；细胞内铜含量与还原型谷胱甘肽（GSH）用试剂盒测定；MeRIP-qPCR检测STAT6 mRNA m⁶A修饰，m⁶A dot blot及定量试剂盒测整体m⁶A水平；染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）验证STAT6结合Nrf2及miR-139启动子区；双荧光素酶报告基因检测Nrf2启动子活性；分析公共单细胞RNA测序数据集（GSE135893，IPF患者vs正常肺）及GTEx正常肺转录组数据评估STAT6通路活性与METTL3/IGF2BP2/FDX1相关性；Western blot检测METTL3、STAT6、p-STAT6、ATP7A、FDX1、FN（fibronectin）、α-SMA、DLAT寡聚体、Fe-S簇蛋白（SDHB、ETFDH）及HSP70表达；Actinomycin D追踪STAT6 mRNA稳定性。

研究结果如下：

Copper ionophores trigger activated fibroblast cuproptosis to ameliorate pulmonary fibrosis（铜离子载体触发活化成纤维细胞铜死亡改善肺纤维化）：BLM诱导纤维化小鼠给予ES、Dis或NSC后，肺组织病理示肺泡间隔增厚减轻、胶原沉积减少（天狼猩红与Masson染色），α-SMA⁺肌成纤维细胞显著减少；分离的肺成纤维细胞中DLAT出现寡聚化（黄色斑点），胞内铜升高，Fe-S簇蛋白ETFDH与SDHB下调、HSP70上调；TTM共处理可挽救细胞活力、恢复GSH、消除DLAT寡聚化并恢复FN与α-SMA表达；凋亡、铁死亡、坏死性凋亡及氧化应激抑制剂均不能阻断铜离子载体诱导死亡。结论：铜离子载体通过铜依赖的cuproptosis选择性清除肌成纤维细胞并逆转纤维化。

Activated fibroblasts exhibit heightened sensitivity to copper ionophore-induced cuproptosis with deactivation of STAT6 signaling pathway and restoration of FDX1 and ATP7A（活化成纤维细胞对铜离子载体诱导的铜死亡更敏感且伴STAT6信号失活及FDX1与ATP7A改变）：原代成纤维细胞显示BLM来源活化成纤维细胞基础铜更低、ATP7A更高、FDX1更低，但对ES诱导的细胞毒性更敏感——铜蓄积更多、GSH耗竭更明显、DLAT寡聚化更强；ES处理下调活化成纤维细胞中ATP7A、上调FDX1，并抑制p-STAT6及总STAT6。结论：活化肌成纤维细胞对cuproptosis更敏感，铜离子载体通过抑制STAT6并重塑铜外排（ATP7A↓）与Cu⁺生成（FDX1↑）创造促cuproptosis微环境。

Copper ionophores induce activated fibroblast cuproptosis through STAT6 signaling pathway（铜离子载体通过STAT6信号通路诱导活化成纤维细胞铜死亡）：scRNA-seq分析示IPF肺成纤维细胞中STAT6通路活性显著高于正常，IF示p-STAT6在PDGFR⁺活化成纤维细胞中升高且被ES抑制；Stat6 cKO小鼠BLM造模后纤维化程度轻于野生型，α-SMA与FN降低；TGFβ1活化WT成纤维细胞经ES处理后STAT6 mRNA与蛋白下调、铜蓄积、DLAT寡聚化增强；STAT6过表达削弱ES诱导的铜蓄积、GSH耗竭与DLAT寡聚化并部分恢复FN与α-SMA；Stat6 cKO来源活化成纤维细胞对ES敏感性增强（铜更高、GSH更低、活力更差、DLAT寡聚化更强）。结论：STAT6是cuproptosis的负向门控分子，维持铜稳态抑制铜毒性，其失活是铜离子载体触发肌成纤维细胞cuproptosis的必要条件。

METTL3 is the core m6A regulator in copper ionophore-induced cuproptosis in PF（METTL3是肺纤维化中铜离子载体诱导铜死亡的核心m⁶A调控因子）：铜离子载体处理的BLM纤维化肺成纤维细胞整体m⁶A水平下降，m⁶A写入酶中仅METTL3在mRNA与蛋白水平显著下调，体外纯化METTL3酶活性不被铜离子载体直接抑制——说明m⁶A降低源于METTL3表达减少而非酶活抑制；TGFβ1活化成纤维细胞中METTL3过表达恢复整体m⁶A、减弱ES诱导的铜蓄积、GSH耗竭、DLAT寡聚化及FN/α-SMA下调；体内AAV9-METTL3过表达削弱ES抗纤维化效果，原代成纤维细胞中恢复STAT6、ATP7A表达并抑制FDX1，cuproptosis表型被阻断。结论：METTL3通过控制其甲基转移酶活性水平（非直接催化抑制）调控铜离子载体诱导的成纤维细胞cuproptosis。

METTL3 restrains cuproptosis in activated fibroblasts by regulating STAT6 via m6A modification（METTL3通过m⁶A修饰调控STAT6抑制活化成纤维细胞铜死亡）：铜离子载体降低纤维化肺成纤维细胞STAT6 mRNA，生物信息学预测STAT6 mRNA +791 bp处有高置信度m⁶A位点，MeRIP-qPCR证实离子载体处理后STAT6 mRNA m⁶A修饰减少，Actinomycin D示STAT6 mRNA半衰期缩短；scRNA-seq示METTL3高表达成纤维细胞STAT6通路活性更高；TGFβ1活化成纤维细胞中METTL3过表达恢复STAT6 mRNA m⁶A修饰及STAT6转录本水平；METTL3与STAT6共敲低（siSTAT6）取消METTL3过表达对cuproptosis的保护——铜蓄积加剧、GSH更低、死亡更多、DLAT寡聚化增强。结论：METTL3催化的m⁶A修饰稳定STAT6 mRNA，STAT6是其下游效应分子，METTL3–STAT6轴保护成纤维细胞免于cuproptosis。

IGF2BP2 stabilizes STAT6 mRNA via m6A recognition to suppress cuproptosis and sustain fibroblast survival（IGF2BP2通过识别m⁶A稳定STAT6 mRNA抑制铜死亡维持成纤维细胞存活）：铜离子载体处理的BLM纤维化成纤维细胞中m⁶A阅读蛋白IGF2BP2选择性下调；IGF2BP2过表达减轻ES诱导铜蓄积、GSH耗竭、细胞死亡及DLAT寡聚化，恢复STAT6 mRNA及FN/α-SMA；IGF2BP2与STAT6表达在原代成纤维细胞中正相关，STAT6 mRNA含A791与A2881两个m⁶A位点匹配IGF2BP2结合基序；STAT6敲低抵消IGF2BP2过表达对cuproptosis的抗性。结论：IGF2BP2作为m⁶A阅读蛋白结合并稳定STAT6 mRNA，维持STAT6表达从而抑制cuproptosis。

STAT6 sustains ATP7A expression via miR-139 suppression to restrain cuproptosis（STAT6通过抑制miR-139维持ATP7A表达以限制铜死亡）：铜离子载体下调ATP7A、上调FDX1，STAT6过表达回补ATP7A并抑制FDX1上调；GSEA示STAT6正调控基因在ATP7A高表达成纤维细胞中富集；miR-139已知靶向抑制ATP7A，铜离子载体上调miR-139，STAT6过表达抑制miR-139；ChIP-qPCR与双荧光素酶报告证实STAT6结合miR-139上游调控区并转录抑制其表达；miR-139模拟物加重ES诱导铜蓄积、DLAT寡聚化、GSH耗竭及死亡，下调ATP7A与FN/α-SMA，STAT6共表达部分挽救。结论：STAT6通过转录抑制miR-139维持ATP7A介导铜外排，限制胞内铜过载与cuproptosis。

STAT6 suppresses FDX1 expression via Nrf2 to mitigate copper toxicity（STAT6通过Nrf2抑制FDX1以减轻铜毒性）：scRNA-seq示FDX1与STAT6通路活性负相关；Nrf2过表达下调FDX1但不影响STAT6/ATP7A，减轻ES诱导GSH耗竭、死亡及DLAT寡聚化且不改变铜含量；GTEx与scRNA-seq交集示STAT6与Nrf2共调控基因及表达正相关；STAT6过表达上调Nrf2 mRNA并促进Nrf2启动子荧光素酶活性，ChIP-qPCR定位STAT6结合Nrf2启动子保守位点；Nrf2敲低取消STAT6过表达对FDX1的抑制并恢复ES敏感性（铜蓄积增加、GSH更低、DLAT寡聚化增强）。结论：STAT6转录激活Nrf2，Nrf2抑制FDX1表达从而减少Cu⁺生成，构成STAT6–Nrf2–FDX1轴减轻铜毒性并抑制cuproptosis。

讨论部分总结：本研究证明铜离子载体通过诱导活化肌成纤维细胞cuproptosis逆转肺纤维化，揭示METTL3–m⁶A–STAT6–IGF2BP2表观转录调控轴及STAT6双重铜稳态调控（抑制miR-139维持ATP7A外排、激活Nrf2抑制FDX1减少Cu⁺生成），首次在纤维化背景下阐明cuproptosis的可靶向性。铜离子载体（如Disulfiram）具FDA批准安全性，具老药新用潜力，METTL3–STAT6–Nrf2轴为可成药靶点。后续需在IPF患者来源成纤维细胞及3D肺模型中验证，并考察肺泡上皮与免疫细胞响应以完善机制与寻找疗效监测标志物。

结论翻译：综上所述，本研究通过证明铜离子载体诱导cuproptosis选择性清除活化肌成纤维细胞以逆转肺纤维化，并阐明METTL3介导的STAT6 mRNA m⁶A修饰及STAT6–Nrf2–FDX1轴这一分子机制，填补了当前肺纤维化治疗领域的空白，为靶向治疗开发提供了新方向，有望推动IPF及其他纤维化疾病的诊治改善患者预后与生活质量。