《Journal of Advanced Research》：Insig1 deficiency protects against acute kidney injury via targeting Dapk3
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急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的特征是肾功能快速下降，且常与肾小管细胞死亡相关。胰岛素诱导基因1（Insig1）作为胆固醇代谢的关键调控因子，此前尚未被证实参与AKI的发病过程。
本研究旨在考察Insig1在AKI中的作用及其潜
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的特征是肾功能快速下降，且常与肾小管细胞死亡相关。胰岛素诱导基因1（Insig1）作为胆固醇代谢的关键调控因子，此前尚未被证实参与AKI的发病过程。
本研究旨在考察Insig1在AKI中的作用及其潜在机制。
研究人员结合肾小管特异性Insig1敲除小鼠，并构建顺铂或缺血-再灌注（ischemia–reperfusion，I/R）损伤模型，同时联合体外肾小管细胞模型，以明确其在AKI中的作用。采用蛋白质组学（proteomics）鉴定Insig1相互作用靶标，并通过通路抑制验证其在顺铂诱导AKI小鼠中的治疗潜力。
研究发现，在AKI患者肾活检样本以及顺铂或I/R诱导的AKI小鼠模型中，Insig1均显著下调。在肾小管上皮细胞中条件性敲除Insig1，可在上述小鼠模型中显著减轻肾损伤。机制上，研究表明Insig1可与死亡相关蛋白激酶3（death-associated protein kinase 3，Dapk3）相互作用，从而稳定Dapk3蛋白水平。无论敲低Insig1还是敲低Dapk3，均可减轻小鼠肾小管上皮细胞（mouse renal tubular epithelial cells，mPTC）中的顺铂诱导细胞凋亡；相反，二者过表达均会加重细胞损伤。此外，采用HS148对Dapk3进行药理学抑制，能够在顺铂诱导AKI小鼠中重现Insig1缺失所产生的肾保护效应。
研究结果揭示了一个新的Insig1/Dapk3轴，其作为AKI进展的关键调控通路，提示该通路在临床上具有成为治疗靶点的潜力。
该文发表于《Journal of Advanced Research》，围绕急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）中肾小管细胞凋亡的分子调控机制展开。AKI是临床常见且严重的综合征，表现为肾功能短时间内迅速下降，常由药物毒性、缺血和脓毒症等因素诱发，住院患者中发病率和死亡率均较高，同时也是慢性肾病及终末期肾病的重要危险因素。当前AKI治疗仍以支持治疗为主，因此寻找新的致病机制与干预靶点具有重要意义。既往研究已表明，凋亡是AKI发生发展中的核心病理事件之一，及时抑制肾小管上皮细胞凋亡可明显减轻肾损害。Insig1是定位于内质网膜的代谢调节蛋白，经典功能主要涉及胆固醇和脂肪酸代谢稳态维持，但其在AKI中的作用此前尚不明确。研究人员基于临床样本和实验模型观察到Insig1在AKI中表达下降，因而进一步系统评估其在肾小管损伤中的功能，并探索其下游作用分子。研究最终证明，Insig1并非保护因子，而是AKI进展中的促损伤因子；肾小管特异性缺失Insig1可减轻顺铂及缺血-再灌注诱导的AKI，核心机制在于Insig1通过稳定Dapk3促进肾小管上皮细胞凋亡。该研究的重要意义在于揭示了一个此前未被认识的Insig1/Dapk3信号轴，为AKI干预提供了新的分子靶点，并提示Dapk3药理抑制可能具有转化应用价值。
研究人员采用的关键技术方法主要包括：利用Kap-Cre与Insig1
flox/flox小鼠构建肾近端小管特异性Insig1条件性敲除模型，并建立顺铂诱导及双侧肾缺血-再灌注AKI模型；体外使用小鼠近端肾小管细胞（mPTC）进行siRNA敲低与质粒过表达；结合LC-MS/MS蛋白质组学筛选Insig1相互作用蛋白，并通过免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光、Western blot、流式细胞术、TUNEL及PAS染色进行验证；人类样本来源于儿童肾癌患者配对邻近正常肾组织活检，另结合KPMP数据库进行表达分析；同时应用Dapk3抑制剂HS148开展体内药理学验证。
一、Insig1 is downregulated in renal tubules of clinical and experimental AKI
研究首先从临床与动物两个层面分析Insig1的表达特征。KPMP数据库显示，AKI患者肾组织中Insig1表达显著低于健康对照。免疫荧光结果表明，Insig1主要定位于肾小管。在顺铂诱导和I/R诱导的AKI小鼠模型中，免疫组化及Western blot进一步证实肾组织Insig1蛋白明显下调。该部分结果说明，Insig1表达改变与AKI密切相关，且其变化具有跨物种与跨模型一致性，为后续功能研究奠定了基础。
二、Genetic deletion of tubular Insig1 ameliorates cisplatin-induced AKI
为明确Insig1在AKI中的功能，研究人员构建了肾小管特异性Insig1条件性敲除（cKO）小鼠。原代肾小管细胞检测证实敲除效率可靠。在顺铂刺激后，野生型小鼠出现显著肾功能损害，表现为血清肌酐（Cr）和血尿素氮（BUN）升高；而cKO小鼠上述指标明显改善。PAS染色显示，Insig1缺失减轻了肾小管上皮空泡变性、刷状缘脱落及管型形成等病理损伤。损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）蛋白表达下降，炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA水平降低，TUNEL染色提示肾组织凋亡显著减少。这些结果表明，肾小管中Insig1缺失可显著缓解顺铂诱导的AKI。
三、Insig1 promotes cisplatin-induced apoptosis in renal tubular cells
在体外mPTC模型中，研究人员进一步聚焦于细胞凋亡。敲低Insig1后，顺铂诱导的裂解型Caspase-3/总Caspase-3（c-casp3/Casp3）比值下降，Annexin V/PI流式检测显示凋亡细胞比例减少。相反，过表达Insig1则增加c-casp3/Casp3比值，并显著加重顺铂诱导的细胞凋亡。进一步地，研究人员通过尾静脉水动力学注射在体内过表达Insig1，结果显示顺铂处理后小鼠肾功能恶化，肾小管细胞凋亡增加。该部分从得失功能两个方向共同证明，Insig1在肾小管上皮细胞中具有促凋亡、促损伤作用。
四、Proteomic profiling identifies Dapk3 as a downstream target of Insig1
为寻找Insig1的下游机制，研究人员在mPTC中进行基于LC-MS/MS的蛋白质组学筛选，鉴定出死亡相关蛋白激酶3（Dapk3）为潜在相互作用蛋白。AlphaFold3结构建模预测了Insig1与Dapk3之间的特异性分子结合位点。免疫荧光显示二者在肾小管中共定位，Co-IP实验进一步验证了二者直接相互作用。功能上，Insig1过表达可上调Dapk3蛋白水平。鉴于Dapk3可经泛素-蛋白酶体途径降解，研究进一步使用蛋白酶体抑制剂MG132，发现其可逆转Insig1敲低导致的Dapk3下降；泛素化实验则显示，Insig1过表达抑制Dapk3泛素化。由此可见，Insig1通过抑制Dapk3泛素化降解而维持其蛋白稳定性，这是该研究揭示的关键分子机制。
五、Dapk3 mediates pro-apoptotic effects in cisplatin-induced tubular injury
在明确相互作用后，研究继续验证Dapk3是否为功能性下游分子。体外实验显示，敲低Dapk3可降低顺铂诱导的c-casp3/Casp3比值，并减少Annexin V/PI阳性细胞；相反，Dapk3过表达则增强Caspase-3活化并促进细胞凋亡。该结果表明，Dapk3是顺铂诱导肾小管细胞凋亡的重要执行分子。结合前述Insig1可直接结合并稳定Dapk3的证据，可以得出Insig1通过Dapk3介导促凋亡效应，从而推动肾小管损伤。
六、Pharmacological inhibition of Dapk3 attenuates cisplatin-induced kidney injury
为了评估该信号轴的治疗潜力，研究人员选用选择性Dapk3抑制剂HS148进行药理学干预。结果显示，HS148处理后，肾组织ATP水平升高，提示Dapk3活性受到抑制。在mPTC中，HS148与Dapk3敲低联用并未进一步降低c-casp3/Casp3比值，说明二者作用于相同通路。在顺铂AKI小鼠中，HS148显著降低BUN和Cr水平，下调肾损伤分子1（KIM-1）蛋白表达，改善PAS染色所示组织病理损伤，减少TUNEL阳性凋亡细胞，并抑制IL-1β表达上调。该部分结果说明，药物性抑制Dapk3能够重现Insig1缺失的肾保护表型，从而支持Dapk3为Insig1促损伤作用的关键下游效应分子，也提示Insig1/Dapk3轴具有可干预性。
七、Tubule-specific Insig1 deletion protects against ischemia/reperfusion-induced AKI
除顺铂模型外，研究还在I/R模型中验证了Insig1的作用。结果显示，双侧肾I/R后，肾小管特异性Insig1 cKO小鼠的Cr和BUN较野生型降低，提示肾功能改善。PAS染色显示cKO小鼠肾小管刷状缘保存较好、扩张减轻，NGAL表达亦明显下降。该部分结果表明，Insig1的致病作用并不局限于药物性AKI，在缺血性AKI中同样存在，从而增强了结论的普适性。
讨论部分指出，AKI中肾小管损伤和细胞凋亡是核心事件，而Insig1在代谢调节之外还具有促凋亡功能。尽管AKI中Insig1表达下降，但遗传性完全缺失Insig1反而带来保护作用，提示这种下调可能属于机体针对损伤的代偿性适应反应，但其幅度不足以完全抵御病理打击。机制研究显示，Insig1通过结合并稳定Dapk3，促进Caspase-3活化和肾小管上皮细胞凋亡。补充结果还提示，Insig1敲低可减少顺铂诱导的活性氧（ROS）生成，而调控GSDMD-N和GPX4未见明显变化，说明其作用主要集中于凋亡，而非焦亡或铁死亡。在I/R模型中，Insig1缺失也有保护作用，但弱于顺铂模型，提示在炎症、氧化应激和血管内皮功能障碍共同参与的复杂损伤背景下，单纯抗凋亡干预的效应相对有限。文章同时指出，该研究仍存在局限，如AKI中Insig1下调的上游调控机制尚不明确，Insig1/Dapk3轴在炎症、氧化应激和代谢重编程中的更广泛作用尚待进一步阐明。
研究结论部分可译为：
总之，该研究鉴定出Insig1是急性肾损伤的重要促进因子，这一作用主要通过其对肾小管细胞凋亡的调控实现。上述发现提示，抑制Insig1可能成为一种具有前景的干预策略。机制上，研究证明Insig1通过稳定细胞死亡关键执行分子Dapk3发挥促凋亡作用，从而揭示了肾小管损伤中此前未被认识的Insig1/Dapk3信号轴。总体而言，这些结果不仅推进了对AKI发病机制的理解，也为靶向Insig1/Dapk3通路治疗AKI开辟了新的方向。
