基于GC-MS与LC-HRMS/MS的未成熟与成熟龙葵（Solanum nigrum Linn.）浆果非靶向代谢组学分析

《Journal of Agriculture and Food Research》：Untargeted metabolomic profiling of unripe and ripe Solanum nigrum Linn. berries using GC-MS and LC-HRMS/MS

龙葵（Solanum nigrum Linn.）是一种重要的促进健康的植物，也是生物活性化合物的丰富来源。尽管具有健康益处，其具有药用活性的浆果仍未得到充分利用，有待进一步探索。随着浆果成熟，其代谢组成发生自然变化，但尚未有全面报道。在本研究中，研究人员采用整合GC-MS与LC-HRMS/MS的非靶向代谢组学方法，对未成熟与成熟浆果之间的代谢差异进行了研究。共检测到1154个特征峰，经数据筛选后保留445个代谢物。主成分分析（PCA）证实了未成熟与成熟浆果之间存在明显分离。单变量分析鉴定出125个差异积累代谢物，其中70个在未成熟浆果中富集，55个在成熟浆果中富集。未成熟浆果积累甾体糖生物碱（steroidal glycoalkaloids）、萜类化合物（terpenoids）及其他防御相关代谢物，表明早期发育阶段植物防御机制活跃。相比之下，成熟浆果黄酮类（flavonoids）、苯丙素类（phenylpropanoids）、糖类及氨基酸水平升高，反映了适口性和营养品质的增强。代谢物集富集分析（MSEA）显示，未成熟浆果与生物素（biotin）、嘧啶（pyrimidine）、抗坏血酸（ascorbate）及醛糖酸（aldarate）等代谢途径相关；而成熟浆果则表现出碳水化合物和氨基酸代谢途径的富集。虽然这些途径基于p值（p ≤ 0.05）具有显著性，但经FDR校正（q > 0.05）后，仅将其解释为探索性趋势。总体而言，本研究证明了代谢转变的存在，并为龙葵浆果成熟过程中代谢动态提供了全面见解。

本研究由Sowmiya Gunasekaran和Chinnappan A. Kalpana完成，发表于《Journal of Agriculture and Food Research》。研究旨在系统解析龙葵浆果在成熟过程中的代谢组学变化，为这一未被充分利用的药食同源资源的开发与利用提供科学依据。

龙葵（Solanum nigrum Linn.，又称黑龙葵）为茄科（Solanaceae）植物，原产于欧亚大陆，广泛分布于热带及亚热带地区。该植物在传统医学中应用广泛，其叶片和浆果因具有胃保护效应而被食用。然而，尽管龙葵叶片的消费日益增加，但具有药用活性的浆果部分仍未得到充分利用。浆果呈卵形，成熟过程中颜色由绿色转变为深黑紫色。未成熟浆果因含有较高水平的生物碱而被传统认为具有毒性，但其在现代医药领域因生物活性特征而获得了显著的药理学关注；完全成熟的浆果则用于治疗胃溃疡、腹泻等胃部疾病以及哮喘、慢性咳嗽等呼吸系统疾病。果实成熟是一个与果实生化组成变化相关的不可逆过程，酚类、黄酮类等生物活性化合物的积累受成熟过程的强烈调控，以最大化其治疗潜力。

尽管前期研究已对龙葵浆果的个别代谢物进行了表征，如未成熟浆果中的甾体糖生物碱（solasonine、solamargine、solasodine等）具有肝保护和抗氧化活性，成熟浆果中含有对A549细胞具有细胞毒性的新型甾体生物碱以及由SnMYB转录因子调控积累的八种不同花青素，但现有研究多聚焦于单一或少数代谢物，缺乏对浆果成熟过程中整体代谢轮廓动态变化的系统性认识。非靶向代谢组学作为一种能够快速、准确且广泛覆盖地检测代谢物的分析工具，为全面解析这一科学问题提供了可能。然而，植物固有的化学多样性为全面捕获代谢组带来了显著挑战，通常需要整合多种分析技术。基于此，研究人员开展了一项针对未成熟与成熟龙葵浆果的非靶向代谢组学研究。

研究人员从印度泰米尔纳德邦哥印拜陀当地市场采集了500克龙葵浆果样本，经植物分类学家鉴定后，依据表面颜色手动分拣为绿色未成熟浆果（SNU）和黑紫色成熟浆果（SNR）。样本经冷冻干燥后，分别采用GC-MS和LC-HRMS/MS两种互补技术平台进行代谢物提取与分析。GC-MS分析前需对样本进行甲基肟-硅烷化衍生处理，采用Shimadzu Triple Quadrupole GCMS-TQ? 8040 NX系统配合SH-Rxi-5Sil MS毛细管色谱柱，以氦气为载气，在全扫描模式下采集m/z 50-650范围内的质谱数据，通过与NIST11和Wiley 8标准谱库比对进行化合物鉴定。LC-HRMS/MS分析采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱进行色谱分离，以含0.1%甲酸的水-乙腈体系为流动相进行梯度洗脱，在Waters XEVO-G2-XS-QTOF高分辨质谱仪的正负电喷雾电离（ESI⁺/ESI^-）模式下采集数据，质量扫描范围为m/z 50-2000。原始数据经转换为mzML格式后，使用MS-DIAL软件（Version 4.9.2）进行峰提取、对齐和解卷积处理，通过与MassBank等公共数据库以及MS-DIAL公共MS/MS谱库比对进行代谢物注释，并经人工 curated 筛选后保留具有生物学意义的代谢物。随后，利用ClassyFire工具进行化学分类，采用MetaboAnalyst 6.0进行主成分分析（PCA）、单变量分析（t检验、倍数变化分析）、层次聚类分析（HCA）以及代谢物集富集分析（MSEA）。

**化学分类与整体代谢轮廓**

经数据处理后，445个代谢物被保留用于后续分析。化学分类结果显示，龙葵浆果包含八种化学超类，涵盖初级和次级代谢物，主要包括：脂质及类脂质分子（105个，占23.60%）、有机氧化合物（73个，占16.40%）、有机杂环化合物（72个，占16.20%，原注92个应为笔误，按百分比核算）、有机酸及其衍生物（72个，占16.18%）、苯丙素类和聚酮类（45个，占10.11%）、生物碱及其衍生物（31个，占6.97%）、苯类化合物（28个，占6.29%）以及其他化合物（26个，占6.52%）。这一多样化的代谢特征表明龙葵浆果具有丰富的化学多样性。

**主成分分析揭示成熟阶段分离**

无监督的主成分分析（PCA）在未成熟与成熟浆果之间显示出清晰的分离。对于LC-HRMS/MS ESI⁺模式，PC1解释62.8%的方差，PC2解释23.8%，累积方差达86.6%；ESI^-模式的累积方差为87.6%；GC-MS平台的累积方差为86.9%。三个分析平台均显示出高度的组间区分度，表明浆果成熟过程中发生了显著的代谢重编程。

**差异积累代谢物鉴定**

通过单变量分析（t检验，p < 0.05）和倍数变化分析（FC ≥ 2），共鉴定出125个差异积累代谢物（DAMs），其中GC-MS平台26个、ESI⁺模式81个、ESI^-模式18个。依据log₂FC ≥ 1为成熟浆果富集、log₂FC ≥ -1为未成熟浆果富集的标准，70个代谢物在未成熟浆果中下调（即未成熟浆果中更高），55个在成熟浆果中上调。

层次聚类分析（HCA）热图进一步验证了上述代谢转变模式。GC-MS热图显示，成熟浆果主要富集有机酸和糖醇等初级代谢物，而未成熟浆果则积累天冬氨酸等前体物质；LC-HRMS/MS ESI⁺模式热图表明黄酮类和含氮化合物在成熟浆果中相对丰度增加；ESI^-模式热图则突出茉莉酸、生物素和奎尼酸在未成熟阶段丰富但随成熟显著下调。

具体而言，未成熟浆果中的关键差异积累代谢物包括：α-茄碱（alpha-Solanine）、solasonine等甾体糖生物碱，lysergol、nigericin等防御相关化合物，以及dihydrojasmone、coniferin、quinate（奎尼酸）等。这些代谢物的积累与植物防御、抗微生物保护及早期发育相关。例如，α-茄碱和solasonine参与驱避草食动物和病原体，并贡献未成熟阶段的苦味；dihydrojasmone作为茉莉酸衍生物，在植物防御中发挥重要作用；coniferin作为木质素生物合成的主要储存形式；奎尼酸则是绿原酸类合成的主要碳源。此外，3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮等甲氧基黄酮类化合物的早期积累可能与植物发育初期的光保护功能有关。

成熟浆果中的关键差异积累代谢物包括：daidzein、licoflavone A、corylin等黄酮类及其糖苷化衍生物，gentiobiose、isomaltose、D-fructose等糖类，以及isoleucine、glutamic acid、N-methyl-L-proline等氨基酸。这些变化反映了成熟过程中次级代谢活跃、碳水化合物代谢增强以及氨基酸积累带来的风味改善和营养品质提升。其中，gentiobiose的上调提示其在 anthocyanins 等酚类色素稳定化中的作用；isoleucine和glutamic acid的增加与挥发性酯类前体产生及香气增强相关；N-methyl-L-proline的上调可能代表果实扩张末期可溶性固形物和糖分积累导致的渗透压升高的生理响应。

**代谢途径富集分析**

代谢物集富集分析（MSEA）显示，未成熟浆果中差异积累代谢物与生物素代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、嘧啶代谢等途径相关，这些途径主要涉及氧化还原稳态和核苷酸生物合成等初级代谢过程，在 immature 阶段保持活跃以维持细胞增殖。成熟浆果则富集于精氨酸生物合成、组氨酸代谢、淀粉蔗糖代谢、果糖甘露糖代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、氮代谢以及缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成等途径，反映了碳水化合物积累和氨基酸代谢的增强，与甜味、风味和整体适口性的提升一致。

然而，需要特别指出的是，尽管上述途径基于p值（p ≤ 0.05）显示显著性，但经假发现率（FDR）校正后（q > 0.05），所有途径均未达到统计显著性。因此，这些途径解释应视为探索性趋势而非统计稳健的富集结果。

**研究局限性与未来方向**

本研究存在若干局限性：样本量较小（每组n=3），可能限制了对广泛生物学变异的捕捉；市场采集的样本可能引入遗传和环境因素导致的生物学变异；缺乏质量控制（QC）样本可能影响数据可重复性。尽管研究人员通过内标归一化和中位数归一化最小化了技术变异，但FDR校正后途径显著性的缺失提示结果需谨慎解读。此外，代谢物的功能角色均来自文献推断，未经验实验证；且由于采用探索性非靶向代谢组学方法，鉴定化合物多为推定性鉴定（MSI level 2-3）。未来研究将聚焦于关键代谢物的靶向验证与定量分析，以及生物利用度、营养和抗营养化合物的详细表征。

**研究结论**

综上所述，本项非靶向代谢研究全面概述了龙葵浆果在未成熟和成熟阶段的代谢物特征。整合GC-MS与LC-HRMS/MS分析揭示了未成熟与成熟浆果之间明显的代谢分离和阶段依赖性的代谢转变。未成熟浆果含有显著更高水平的甾体糖生物碱、萜类皂苷及其他植物防御相关代谢物，表明其防御和发育代谢功能；相比之下，成熟浆果表现出苯丙素类、糖苷化黄酮类、脂质及其他与治疗特性相关代谢物的增强积累。未成熟浆果中防御相关代谢物的存在并非品质低劣的标志；相反，这些化合物是植物发育调控的组成部分，支持成功成熟并使浆果转向适口性和适合人类食用。此外，途径富集分析显示，未成熟浆果主要与氧化还原和防御相关途径相关联，突出其在氧化平衡和早期发育控制中的作用；而成熟浆果则显示碳水化合物、氨基酸和黄酮类途径的显著富集，强调了成熟过程中次级代谢产物的产生。这些结果为生物化学和潜在治疗应用提供了宝贵见解，并将有助于功能性食品配方的开发。总体而言，本研究凸显了龙葵浆果的应用前景：未成熟浆果可作为制药探索的生物活性化合物来源，而成熟浆果可用于功能性食品产品开发。