《Journal of Biological Chemistry》：A Dual-Pathway Wnt-IL-13 Fusion Protein Enhances Human Intestinal Regeneration Through Tuft Cell Activation
编辑推荐：
受损的肠道再生反应驱动了严重的炎症性疾病，如炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）和移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD），每年影响全球数百万人。尽管研究广泛，有效疗法仍然有限，目
受损的肠道再生反应驱动了严重的炎症性疾病，如炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）和移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD），每年影响全球数百万人。尽管研究广泛，有效疗法仍然有限，目前尚无治愈性治疗方法。研究人员近期发现人肠道簇细胞（tuft cell）通过Wnt和IL-4/IL-13信号通路促进损伤后的组织修复。基于此发现，研究人员报道了合成Wnt-IL-13融合蛋白的工程构建和功能验证，该蛋白同时激活Wnt和IL-4/IL-13两条信号通路以增强人肠道簇细胞活性。利用人源类器官（organoid）技术，研究人员证明该治疗方法可促进黏膜愈合。持续的肠道上皮更新对于维持或恢复损伤时的上皮完整性至关重要，可防止细菌播散和失控性炎症。该过程主要由肠道干细胞（intestinal stem cell, ISC）和短暂扩增细胞调控。多种生长因子和形态发生素协同作用于隐窝底部的ISC以维持干性并驱动持续的上皮增殖。ISC的破坏或丢失会延迟上皮更新并损害屏障完整性，导致细菌移位至无菌黏膜组织，触发严重炎症反应。此类黏膜完整性受损驱动多种临床疾病，如白血病患者接受造血干细胞移植前预处理方案所致的肠道黏膜炎，或IBD患者的严重肠道溃疡。虽然此类患者的疾病严重程度通过以黏膜愈合为中心的各种内镜评分系统评估，但当前肠道炎症治疗手段主要集中于抑制炎症而非增强上皮修复反应。近期关于人黏膜再生生物学的研究将簇细胞确定为具有上皮修复特性的稀有上皮细胞类型。机制上，簇细胞的发育和增殖关键依赖于Wnt和白介素-4（interleukin-4, IL-4）/白介素-13（interleukin-13, IL-13）信号通路。激活后的簇细胞可作为表皮调节素（Epiregulin, Ereg）和肝素结合表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor, HB-EGF）等生长因子的局部细胞来源，并可转分化为ISC，从而促进组织再生。鉴于Wnt和IL-4/IL-13信号在促进肠道再生中的作用，同时治疗性激活代表了一种有前景的方法，但面临若干障碍。Wnt配体通过结合Frizzled（FZD）和LRP5/6受体激活信号。10种FZD受体（FZD1-10）在组织细胞类型中表现出不同但重叠的表达模式，但其对再生反应的个体贡献尚不完全清楚。治疗开发的主要局限在于Wnt蛋白需要脂质修饰才能与受体结合，使其高度疏水而不适合药物开发。早期研究表明配体诱导的FZD和LRP5/6交联可激活Wnt/β-catenin信号。基于此概念，后续工作证明利用交联拮抗剂强制FZD和LRP5/6受体接近，阻断Wnt与两种受体结合，直接证明受体交联单独足以驱动通路激活，为基于抗体的Wnt替代物（Wnt surrogate）开发奠定了基础。这些工程化双特异性配体促进FZD-LRP5/6异二聚化，有效模拟天然Wnt配体同时规避了天然Wnt蛋白的操作挑战。类似地，IL-4/IL-13轴的治疗性激活既有机遇也有挑战。这些细胞因子对于调节免疫反应和组织修复至关重要，通过涉及IL-4受体α（IL-4 receptor alpha, IL-4Rα）与普通γ链（common gamma chain, γc）配对或IL-13受体α1（IL-13 receptor alpha 1, IL-13Rα1）的I型和II型受体复合物信号转导。虽然IL-4可与I型和II型受体复合物均发生作用，IL-13仅限于通过II型受体复合物信号转导。IL-4/IL-13受体在多种细胞类型中的广泛表达奠定了其在2型免疫反应中的核心作用，包括Th2细胞分化、M2巨噬细胞极化和嗜酸性粒细胞招募。然而，这种广泛的受体分布使治疗应用复杂化，因为全身给药存在脱靶效应风险，包括失控性炎症、过度黏液产生和组织纤维化。因此，将IL-4/IL-13信号空间限制在上皮区域同时最小化全身暴露的策略可提高再生应用的安全性。本研究利用人肠道类器官模型探索靶向簇细胞促进黏膜愈合的新型治疗策略。具体而言，研究人员工程化了一种同时激活Wnt和IL-13信号以增强人肠道簇细胞再生特性的融合蛋白，并展示了概念验证方法用于开发主要作用为增强上皮修复而非单纯抑制炎症的替代治疗药物。
## 研究背景与问题
肠道上皮屏障的持续更新对维持黏膜完整性具有决定性意义。当损伤发生时，肠道干细胞（ISC）及其子代短暂扩增细胞通过协同作用实现上皮再生，这一过程受隐窝底部多种生长因子和形态发生素的精密调控。然而，在某些病理状态下，如接受造血干细胞移植前的白血病预处理患者，或炎症性肠病（IBD）伴发严重溃疡的患者，ISC功能受损或丧失会导致上皮修复延迟，进而引发细菌移位和失控性炎症反应。当前临床评估虽以内镜下黏膜愈合为重要指标，但现有治疗策略多聚焦于免疫抑制，缺乏主动促进上皮修复的手段。
人肠道簇细胞作为一类稀少的上皮细胞亚群，近年来被证实具有独特的上皮修复功能。研究人员的前期工作揭示，簇细胞的发育和增殖依赖于Wnt信号通路及IL-4/IL-13信号通路的协同作用；激活后的簇细胞能够分泌表皮调节素（Ereg）和肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）等促修复因子，并具备向ISC转分化的潜能，从而为组织再生提供细胞来源。然而，将这一生物学发现转化为治疗策略面临多重挑战：天然Wnt蛋白因必需脂质修饰而具有高度疏水性，难以成药；IL-13虽信号范围较IL-4更为局限，但其受体IL-13Rα1/IL-4Rα的广泛分布仍使全身给药存在促纤维化、促炎等脱靶风险。因此，如何在保留双通路协同激活优势的同时，克服分子成药性和靶向特异性难题，成为该领域亟待解决的关键科学问题。
## 主要关键技术与方法
研究人员采用人源回肠类器官体系作为核心研究模型，包括AVIL-Clover簇细胞报告基因类器官和AVIL谱系示踪类器官；利用生物质谱和尺寸排阻色谱技术构建Wnt-IL-13融合蛋白文库；选用Wnt/β-catenin报告基因SuperTOPFlash（STF）质粒稳定转染的A549、Huh7、U2OS和MC3T3细胞系进行Wnt信号活性检测，结合流式细胞术检测STAT6磷酸化评估IL-13信号；运用放射性损伤模型（6 Gy或9 Gy）模拟肠道上皮损伤并观察再生情况；通过对已发表的人回肠类器官单细胞RNA测序数据集（GSE233451）及Gut Cell Atlas原代小肠组织数据集进行再分析，解析Wnt/IL-4/IL-13受体表达谱。
## 研究结果
**Wnt与IL-4/IL-13受体在簇细胞中的表达特征指导融合蛋白工程策略**
研究人员首先系统分析了人肠道上皮不同谱系中Wnt受体的表达模式。基于前期构建的分化培养体系，对经IL-4/IL-13处理或未处理的回肠类器官进行单细胞转录组分析，鉴定出四个簇细胞亚群、干细胞及两种杯状细胞群体。结果显示，四个簇细胞亚群中FZD5和FZD3呈强表达，FZD6中度表达，FZD9表达相对局限（主要富集于tuft-1和tuft-2亚群）；LRP5和LRP6则在所有簇细胞亚群中均有表达。为验证该发现，研究人员进一步分析人原代小肠组织的独立单细胞数据集，证实LRP5/6在簇细胞中强表达，FZD5虽表达水平低于类器官中的簇细胞，但仍是肠道上皮所有谱系（包括干细胞、短暂扩增细胞、肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞）中的主要FZD受体。这些结果为选择FZD5作为广泛激活靶点、FZD9作为簇细胞选择性靶点的融合蛋白设计策略提供了分子依据。
**三特异性Wnt-IL-13融合蛋白的工程化构建以实现双通路共激活**
为验证簇细胞能否通过Wnt和IL-13信号的同时激活而扩增，研究人员设计了一系列三特异性Wnt-IL-13融合蛋白。该构建体将已验证的Wnt替代物格式（包括靶向FZD的抗体和结合LRP5/6的单域抗体可变区VHH）与通过柔性肽 linker 连接的人IL-13融合，具体涉及两种抗FZD抗体（mAb1结合FZD1/2/5/7/8，mAb2结合FZD1/2/4/5/7/8）及LRP6结合VHH。为优化空间构象，IL-13分别融合至抗FZD抗体重链或轻链的N端或C端，形成四种几何变异体。
功能验证表明，所有融合蛋白在HeLa细胞中均能诱导STAT6磷酸化，且效价与重组IL-13相当，证明IL-13活性得以保留。STF报告基因检测显示，在mAb1背景下，轻链或重链C端融合IL-13（C-LC和C-HC）与亲代Wnt替代物活性相当，而N端融合体在A549和Huh7细胞中活性降低；在mAb2背景下，除N端轻链融合体外，其余C端融合体均保持与Wnt替代物相当的活性。这些结果提示C端融合通常更有利于减少IL-13配体与Wnt替代物结构域之间的空间位阻，从而为双通路同时激活提供了有效的分子平台。
**Wnt-IL-13融合蛋白增强人肠道簇细胞介导的再生**
研究人员利用人肠道簇细胞报告类器官评估两种优选融合蛋白（mAb1和mAb2为骨架、IL-13融合于轻链C端）的活性。基线比较显示，相较于不含Wnt的对照组，商业Wnt替代物NGS Wnt使簇细胞频率提升约7倍，mAb2和mAb1为基础的Wnt替代物分别提升5倍和8倍；基于此，后续研究聚焦于mAb1骨架的Wnt-IL-13（C-LC）融合蛋白。联合使用NGS Wnt和IL-13可使簇细胞频率较单独NGS Wnt增加20倍，而mAb1基础Wnt替代物联合IL-13效果更为显著。关键的是，Wnt-IL-13（C-LC）单分子处理可达到与mAb1基础Wnt替代物联合游离IL-13相当的簇细胞扩增效果，证明了单一合成蛋白的等效治疗潜力。
在放射性损伤模型中，研究人员对分化后的人肠道簇细胞报告类器官施加6 Gy照射并追踪9天恢复情况。单独NGS Wnt或IL-13处理均未能使类器官恢复生长，而联合处理组或Wnt-IL-13（C-LC）处理组则成功恢复了生长能力。通过AVIL谱系示踪类ORD类器官进一步验证：经9 Gy照射后，Wnt-IL-13（C-LC）处理不仅恢复了类器官生长，还产生了簇细胞来源的类器官片段（iRFP
+细胞），并整体提升了iRFP标记细胞的频率。这些结果共同证明，工程化Wnt-IL-13融合蛋白能够有效激活簇细胞，在受损人肠道上皮中诱导再生反应。
## 讨论与结论
本研究的核心结论是：研究人员成功构建了具有类药特性的合成Wnt-IL-13融合蛋白，通过同时激活Wnt和IL-13信号通路，增强人肠道簇细胞的再生功能，从而在放射性损伤模型中促进黏膜修复。这一策略基于前期发现的"簇细胞可作为ISC功能受损时的补偿性再生来源"这一生物学原理，将双通路协同激活的概念转化为单一生物大分子治疗实体。融合蛋白的几何优化（特别是C端融合策略）对于保持双通路活性至关重要，而将两种激动剂整合为单一分子不仅简化了药代动力学特性和生产流程，还可能通过空间限制性递送降低IL-13的全身暴露风险。
研究同时指出了当前局限性：尽管Wnt-IL-13融合蛋白在原理上可实现选择性靶向，但现有构建体尚未解决细胞类型特异性问题。当前使用的抗FZD抗体靶向广泛表达的FZD1/2/5/7/8受体，导致交叉反应谱而非簇细胞限制性结合，选择性靶向和潜在脱靶效应有待未来研究解决。此外，功能验证目前仅限于人源类器官模型，未能完全模拟包含内皮、基质和免疫细胞的完整肠道微环境；且由于人IL-13不能有效结合小鼠IL-13受体，标准小鼠模型的适用性受限，未来需借助类芯片微生理系统、人源化小鼠或非人灵长类模型进一步验证转化价值。
作者指出，当前肠道炎症治疗以抑制炎症级联为主，而促进黏膜愈合的策略相对缺乏。选择性增强簇细胞活性可为直接促进上皮修复提供互补甚至协同的治疗新策略。该Wnt-IL-13融合蛋白可作为旨在恢复而非仅仅维持肠道功能的治疗原型。未来优化方向包括：工程化四特异性变体以整合簇细胞特异性受体结合域，或 Redirect 特异性至表达更为受限的FZD9 receptor以提升靶向选择性。关于IL-13和Wnt基治疗的临床转化，参照系统给药的抗体Wnt替代物在IBD I期临床试验中因肝酶升高而终止的前例，将活性限制于肠道局部将是关键考量。
本研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。
