建立IFNAR2基因敲除猪模型以模拟重症登革热样病理改变

《Journal of Medical Virology》：Establishment of an IFNAR2 Knockout Pig Model for Severe Dengue-Like Pathology

　　

登革病毒（DENV）可导致以血浆渗漏、出血表现及多器官功能障碍为特征的重症登革热。现有动物模型，尤其是AG129小鼠，因神经嗜性干扰及对小鼠适应株的依赖，无法充分复现人类血管病变。为解决这一转化医学缺口，研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑联合体细胞核移植技术构建了I型干扰素α/β受体亚基2（IFNAR2）基因敲除（KO）猪。4头KO仔猪经皮内接种在AG129小鼠中非致病性的DENV血清4型临床分离株。其中1头于感染后第7天死亡，表现为胸腔积液、腹水及多器官严重出血性病变。持续病毒血症（105.1拷贝/mL）伴随显著细胞因子升高（肿瘤坏死因子-α 255.1 pg/mL；白细胞介素-12p40 288.1 pg/mL）、肝细胞损伤生化证据（天门冬氨酸氨基转移酶 827.9 U/L）及肾功能障碍。组织病理学显示广泛血管内皮坏死且无中枢神经系统受累，与人类重症登革热血管病变高度相似。其余3头KO猪仅表现为短暂低水平病毒血症，未进展为重症。尽管仅观察到1例重症病例，该发现仍证实IFNAR2 KO猪可复现人类重症登革热标志性特征，为发病机制研究与治疗评估提供了生理相关性较高的大动物平台。

《Journal of Medical Virology》刊发的这项研究针对登革病毒（DENV）感染缺乏理想动物模型的现状，首次构建了I型干扰素α/β受体亚基2（IFNAR2）基因敲除猪模型，成功复现了接近人类重症登革热的病理特征。当前DENV已成为全球传播最快的蚊媒传染病，2024年病例数较二十年前增长近30倍达1460万例，约5%的显性感染者会进展为以血浆渗漏、出血及多器官功能障碍为特征的重症登革热，但目前既无特效抗病毒药物，唯一获批的登革疫苗（Dengvaxia）在血清阴性人群中效果有限且对各血清型保护不全。这一治疗缺口的重要原因是动物模型缺陷：广泛使用的AG129小鼠缺失I型和II型干扰素受体，需依赖小鼠适应株且主要表现为神经嗜性病变而非人类特征性的血管渗漏综合征；非人灵长类动物极少出现重症且受伦理与实操限制难以大规模应用。猪作为潜在模型具有显著转化优势——心血管与免疫系统解剖生理近似人类、体型便于重复采样与成像、基因编辑与饲养体系成熟，且流行区血清学调查显示猪群自然暴露率达34%至49%，既往实验也发现尤卡坦小型猪接种DENV1后可维持病毒血症，同源再攻毒可出现皮疹与真皮水肿等可能与抗体依赖性增强（ADE）相关的表现。研究人员据此假设，选择性敲除IFNAR2可在保留II型（IFN-γ）和III型（IFN-λ）干扰素信号的前提下阻断I型干扰素通路，从而允许DENV复制并进展为重症样血管病变，同时避免小鼠模型的神经嗜性干扰。

研究采用的主要关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑靶向猪IFNAR2基因第7号外显子，通过免疫磁珠富集编辑后的成纤维细胞单克隆，经测序验证双等位基因突变后作为核供体进行体细胞核移植（SCNT），将重构胚胎移植入代孕母猪获得基因修饰猪；实验队列共纳入4头3周龄雄性IFNAR2 KO猪，以4头同年龄性别无特定病原体（SPF）野生型猪为对照，均经皮内接种10⁷TCID₅₀/mL的DENV4临床分离株，按标准化评分系统监测临床症状，采集血清与组织进行病毒载量定量、细胞因子谱检测、血清生化分析及组织病理学与免疫组化检测。

研究结果部分，研究人员首先完成IFNAR2修饰猪成纤维细胞的制备：设计靶向第7号外显子的sgRNA，经T7E1错配切割试验与Sanger测序确认单克隆#1携带+2 bp与+1 bp插入移码突变，可预测导致截短无功能蛋白或mRNA经无义介导降解，完全阻断I型干扰素信号转导，该克隆被选为SCNT核供体。随后通过SCNT生产IFNAR2 KO仔猪：将271枚重构胚胎移植入受体母猪，妊娠至足月自然分娩7头雄性仔猪，基因型鉴定确认所有仔猪均携带与供体细胞一致的双等位基因突变，其中3头于出生后48小时内死于非实验因素，剩余4头用于DENV攻毒。DENV4攻毒后的临床观察显示，仅KO猪#4于攻毒后第7天死亡，其余KO猪与野生型对照均存活至第14天；KO猪#4于攻毒后第5至6天出现高热（最高41.8℃），体温变化规律与人类重症登革热危重期相符，其余动物无持续发热。大体病理检查发现KO猪#4存在腹腔积液、多器官点状出血、弥漫性出血性肠炎、肠系膜淋巴结肿大出血及心内外膜出血，与人类重症登革热血管渗漏及出血表现高度一致。组织病理学进一步证实KO猪#4存在多系统病变，心脏间质出血伴心肌细胞变性，肝脏窦状隙充血，脾脏红髓充血出血伴白髓淋巴细胞耗竭，肾脏间质出血伴小管变性坏死，肠道黏膜下层充血出血伴上皮脱落，肠系膜淋巴结淋巴细胞耗竭出血，尤其关键的是在肠道、肾脏及淋巴结中观察到广泛血管内皮坏死与脱落，这是人类重症登革热血管病变的特征性表现，同时内皮激活标志物ICAM-1、VE-钙黏蛋白及E-选择素仅在KO猪#4中高表达；其余动物未见显著显微病变。免疫组化结果显示KO猪#4多器官中存在广泛DENV4抗原分布，阳性细胞主要为浸润的单核炎症细胞，部分呈凋亡形态，在脾脏与肠系膜淋巴结密度最高，与病理损伤区域空间吻合；存活KO猪仅偶见散在阳性细胞，野生型对照无特异性信号。病毒RNA定量显示KO猪#4血清病毒载量达10^5.1拷贝/mL，组织病毒载量在肠道、肠系膜淋巴结、脾、肝、肾中高达10^4.19至10^6.08拷贝/mg，心脏与脑为阴性；存活KO猪仅检测到低水平组织病毒RNA，野生型对照全为阴性。血清细胞因子谱显示KO猪#4于第7天出现显著促炎与调节性细胞因子升高，其中肿瘤坏死因子-α（255.1 pg/mL）与白细胞介素-12p40（288.1 pg/mL）升幅最大，同时伴有干扰素-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6及抗炎性白细胞介素-10升高，符合人类重症登革热细胞因子失调特征；其余动物细胞因子水平始终接近基线。血清生化参数显示KO猪#4在第7天出现显著多器官功能障碍，肝细胞损伤标志物天门冬氨酸氨基转移酶升至827.9 U/L，肾功能指标血尿素氮（27.2 mg/dL）与肌酐（1.65 mg/dL）升高，脂质代谢紊乱表现为总胆固醇（27 mg/dL）与高密度脂蛋白（7 mg/dL）降低、甘油三酯（154 mg/dL）升高，其余动物生化指标均维持正常范围。

讨论部分指出，该研究首次证明选择性敲除IFNAR2的猪在接种非小鼠适应株的临床分离DENV4后可发展出与人类重症登革热高度相似的病理表型，包括无神经嗜性干扰的系统性血浆渗漏、出血、血管内皮坏死、细胞因子风暴及多器官功能障碍，其表型异质性（4头基因相同猪仅1头重症）也与人类仅约5%显性感染进展为重症的特点一致，为解析重症登革热发病机制提供了更接近人类生理的大动物模型。研究同时指出局限性，包括单重症病例的样本限制、缺乏同期 mock 感染的IFNAR2 KO对照、未进行全基因组脱靶评估等，未来需扩大队列并结合 mock 对照组进一步验证。结论部分强调，尽管仅为概念验证性研究，IFNAR2 KO猪模型已显示出克服传统小鼠模型神经嗜性偏倚的潜力，可作为连接基础研究与临床转化的桥梁，用于血管发病机制解析、治疗药物筛选及疫苗评价。