雌性仓鼠轻度外周型新型冠状病毒肺炎感染后脑内胶质纤维酸性蛋白分布的早期激增

《Journal of Neurochemistry》：Early Surge in Brain GFAP Distribution in Female Hamsters With Mild Peripheral COVID-19

　　

轻度至中度呼吸道新型冠状病毒肺炎（COVID-19）常伴随多种神经系统症状。该主要外周性疾病影响大脑的两大核心机制被认为包括：外周循环细胞因子经受损的血脑屏障进入大脑，和/或直接发生脑部感染。已有研究提出，由此引发的神经炎症可能损害突触传递，导致认知功能障碍。神经炎症的关键特征之一是星形胶质细胞反应性增强，即“星形胶质细胞增生”，其表现为星形胶质细胞形态、增殖能力、基因表达及功能的改变。针对轻度至中度COVID-19背景下不同脑区星形胶质细胞增生的直接研究十分有限。为此，研究人员在叙利亚仓鼠轻度至中度呼吸道COVID-19模型中，对皮层、胼胝体、海马、第三脑室周边及背侧纹状体这五个感兴趣区域（Region of Interest, ROI）的星形胶质细胞变化进行了量化。研究人员在接种后1、3、5、7及31天提取脑组织，并设置未感染对照组，利用星形胶质细胞特异性标志物（胶质纤维酸性蛋白，Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP；SRY-box转录因子9，SRY-box Transcription Factor 9, SOX9）和神经元特异性标志物（神经元核抗原，Neuronal Nuclei, NEUN）进行免疫标记。研究人员采集了全脑切片的大图拼接共聚焦显微图像，并使用新开发的无偏分析流程对上述标志物进行量化。研究发现，接种后3天，雌性仓鼠皮层中GFAP分布出现显著且短暂的升高，同时海马和胼胝体中也观察到非显著性的升高。此外，接种后3天，雌性皮层中还发现了GFAP阳性突起复杂性（反映星形胶质细胞复杂程度的指标）的增加。各时间点均未观察到星形胶质细胞（SOX9）、神经元（NEUN）或总细胞（Hoechst）数量的改变。值得注意的是，所有雄性仓鼠在所有时间点的所有感兴趣区域中均未出现上述变化。本研究首次揭示了COVID-19背景下星形胶质细胞增生的时空特征及性别差异。

研究背景与意义

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2）感染引起，除呼吸道症状外，常伴随从急性期持续到“长期新冠”（Long COVID）阶段的神经系统症状，如“脑雾”、认知障碍等。这些症状的发生机制尚未完全阐明，主流假说认为与神经炎症密切相关。神经炎症可由外周细胞因子透过受损血脑屏障，或由病毒直接入侵大脑引发，进而导致星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。其中，星形胶质细胞增生是神经炎症的核心病理改变之一，其特征为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达上调。然而，既往关于COVID-19相关星形胶质细胞增生的研究多集中于重症病例的尸检分析，对于更为普遍的轻中度患者，其脑内星形胶质细胞反应的时空动态特征、是否存在性别差异，尚缺乏系统的在体研究数据。鉴于女性在长期新冠中的高患病率，解析轻症模型中的性别特异性神经炎症反应具有重要的临床意义。本研究发表于《Journal of Neurochemistry》，旨在通过叙利亚仓鼠模型填补这一空白。

关键技术方法

本研究采用8至10周龄叙利亚金黄地鼠（Mesocricetus auratus）作为研究对象，通过滴鼻方式接种10⁵TCID₅₀（50%组织培养感染剂量）的SARS-CoV-2原始武汉株，建立轻度呼吸道COVID-19模型。研究人员分别在接种后1、3、5、7及31天处死动物并收集脑组织，同时设置未感染对照组。由于生物安全四级实验室的高等级防护要求，脑组织需在10%福尔马林中固定至少30天后方可取出分析。研究人员采用免疫荧光技术标记GFAP、SOX9及NEUN，并利用全脑切片大图拼接共聚焦显微镜成像。为了量化星形胶质细胞的变化，研究团队开发了一套基于MATLAB的无偏自动化分析流程，用于计算GFAP信号密度及SOX9阳性细胞密度。此外，针对GFAP形态复杂性，研究人员建立了基于骨架化分析的评分体系，并结合扫描电子显微镜对超微结构进行了观察。

研究结果

3.1 叙利亚仓鼠模拟轻度COVID-19感染模型

通过监测鼻咽部及肺部的病毒载量，研究人员发现病毒在接种后1天达到峰值，随后逐渐下降，至接种后7天基本检测不到，表明急性感染期结束。体重监测显示，雌雄动物均出现体重减轻及随后的恢复，且雌性动物的体重恢复速度显著快于雄性，这与既往文献报道一致，证实模型构建成功。

3.2 雌性仓鼠在外周SARS-CoV-2感染后表现出急性且短暂的星形胶质细胞反应

研究人员利用定制化分析流程对五个感兴趣区域进行了量化分析。结果显示，在接种后3天，雌性仓鼠皮层的GFAP信号密度较对照组显著升高，同时GFAP阳性突起的复杂性评分也呈双倍增长趋势，虽总体方差分析未达显著，但事后比较显示与对照组差异显著。在海马和胼胝体区域，也观察到了类似的GFAP密度升高趋势，但未达统计学显著性。值得注意的是，雄性仓鼠在所有时间点、所有脑区均未出现GFAP密度的显著改变。SOX9阳性细胞计数结果显示，无论雌雄，各时间点均未发生星形胶质细胞数量的变化，表明该反应为非增殖性的形态学激活。此外，神经元标志物NEUN及总细胞核标记Hoechst的检测未发现细胞死亡或密度改变。扫描电镜结果进一步显示，接种后3天的雌性皮层星形胶质细胞内存在溶酶体聚集及线粒体嵴结构的潜在改变。

讨论与结论总结

本研究通过定量成像分析，首次描绘了轻中度呼吸道COVID-19背景下星形胶质细胞增生的时空图谱及性别差异。研究发现，这种增生表现为GFAP分布和形态复杂性的短暂增加，局限于雌性个体的急性期（接种后3天），且不伴随星形胶质细胞增殖或神经元丢失。这一发现与既往转录组学中发现的雌性特异性“炎症反应”基因富集现象相呼应，提示女性在应对外周病毒感染时，中枢神经系统可能产生独特的神经炎症反应模式。

研究人员指出，虽然GFAP是经典的星形胶质细胞标志物，但其表达受多种生理因素影响，未来研究需结合Ezrin等更特异的功能性标志物来验证星形胶质细胞的状态转换。此外，皮层和海马的高血管化程度可能使其更易受到外周炎症因子的侵袭，从而引发胶质反应。

结论

综上所述，本研究开发了一种适用于大视野共聚焦脑图像的新型无偏分析流程。核心数据支持在轻度COVID-19感染后，雌性仓鼠皮层出现短暂且性别特异性的GFAP分布增加，而星形胶质细胞总数无明显变化。除了为轻中度呼吸道COVID-19的星形胶质细胞增生提供了首个时空维度的证据外，本研究还进一步支持了雌雄星形胶质细胞对炎症刺激的反应存在差异的观点。鉴于越来越多的证据表明COVID-19症状存在性别差异，本研究的数据提出了一种可能性：即增强的星形胶质细胞增生可能参与了女性COVID-19患者中不成比例发生的神经系统症状。