人类非编码RNA中超稳定G-四链体结构的发现及其ATP结合特性

《Non-coding RNA Research》：Discovery of a G-rich ultra stable human ncRNA G-quadruplex that binds ATP

热稳定性RNA基序已被证明是构建多种应用场景纳米颗粒的独特材料。本研究报道了一种源自人类的富含鸟嘌呤（G-rich）超稳定非编码RNA（ncRNA）G-四链体（G-quadruplex, G4），其具有结合腺苷三磷酸（ATP）的能力，并具备成为药物递送载体的巨大潜力。运动是生命系统的关键特征，可通过ATP酶生物马达实现。人体每日合成、代谢及消耗的ATP总量约等同于自身体重。鉴于人体内大量存在的非编码RNA，研究人员预期许多短链或长链非编码RNA将参与ATP的结合与水解过程。这一推测的依据在于：尽管目前已报道的所有ATP酶均为蛋白质，但人类基因组中仅1.5%的序列编码蛋白质，剩余98.5%的序列转录为非编码RNA，这些RNA在调控生命活动功能中发挥着至关重要的作用。研究人员通过体外筛选人细胞提取的内源性非编码RNA，发现了一种能够结合ATP的内源性人类非编码RNA G-四链体。该ATP结合RNA经证实可形成G-四链体结构，并通过ATP亲和柱层析结合实验与圆二色光谱（CD）进行了表征。这种紧密折叠、结构紧凑的RNA纳米颗粒将为药物偶联及治疗性递送提供一种全新的功能性纳米材料类别，既可作为靶点也可作为载体。

《Non-coding RNA Research》论文解读：人类超稳定G-四链体非编码RNA的ATP结合特性及纳米医学应用前景

研究背景与意义

人类基因组测序揭示了一个颠覆性事实：虽然大部分基因组被转录，但仅有1.5%的序列编码蛋白质，其余98.5%曾被视为“垃圾DNA”，实则转录为短链或长链非编码RNA（sncRNA或lncRNA），在催化、支架构建及基因调控等细胞功能中发挥核心作用。生命的本质特征是运动，而这种运动由ATP酶（ATPase）马达驱动。ATP作为“生命货币”，驱动着肌肉收缩、DNA复制等关键生命过程。人体每日合成与代谢的ATP总量可达50至70公斤，约等于自身体重。长期以来，科学界默认所有ATP酶均为蛋白质，但基于非编码RNA的丰度及其重要性，研究人员推测存在能够结合甚至水解ATP的非编码RNA。然而，此前从未从人类转录组中鉴定出能够结合ATP的RNA，尤其是能够形成G-四链体结构的ATP结合RNA尚未见报道。本研究旨在填补这一空白，寻找内源性ATP结合RNA，并探索其作为新型RNA纳米材料的潜力。该研究由郭培宣（Peixuan Guo）团队完成，发表于《Non-coding RNA Research》。

主要关键技术方法

研究人员采用HT-29人结肠癌细胞作为初始样本来源。核心技术手段包括：利用体外筛选技术（In vitro selection），对去除核糖体RNA（rRNA）后的总RNA池进行四轮ATP-琼脂糖亲和柱筛选；通过高通量测序鉴定富集的RNA序列；利用圆二色光谱（CD）对候选RNA的二级结构进行生物物理表征；通过生物信息学分析确定RNA序列在人类基因组中的定位；利用ATP亲和柱洗脱实验验证RNA与ATP的结合特异性及亲和力。

研究结果

1. Isolation and screening of ATP-binding RNAs（ATP结合RNA的分离与筛选）

研究人员从HT-29细胞中提取总RNA，经质量检测后去除rRNA并进行文库构建。经过四轮针对C8位点连接的ATP-琼脂糖亲和柱的筛选，利用ATP缓冲液进行特异性洗脱，最终在第4轮筛选后观察到单一明显的条带，表明目标序列已高度富集。随后的测序结果显示，排名第一的序列占据了超过30%的读段。

2. Discovery and biophysical characterization of G-quadruplex structure in the ATP-binding RNA（ATP结合RNA中G-四链体结构的发现与生物物理表征）

排名第一的序列被命名为ATPseq1。序列分析显示其含有高度富集的G区域，符合G-四链体（G4）的特征序列基序（G_≥2L_n1G_≥2L_n2G_≥2L_n3G_≥2，L指长度不定的连接区）。机器学习算法G4RNA预测其G4NN值高达0.7812，远超阈值0.5。圆二色光谱（CD）分析证实，ATPseq1在含钾离子（K⁺）的缓冲液中呈现出平行G-四链体的典型特征峰（265 nm正峰，240 nm负峰），而在锂离子（Li⁺）缓冲液中则无此特征，证明了K⁺依赖性。此外，在305 nm处出现的特征峰表明其形成了一种特殊的六联体:四联体（hexad:tetrad）亚型结构。研究发现镁离子（Mg²⁺）会导致该RNA沉淀，且该沉淀可被单价阳离子逆转，暗示可能存在G-线（G-wire）的形成。排名第二和第三的序列（ATPseq2和ATPseq3）虽也形成G-四链体，但后续实验证明其不具备ATP结合能力。

3. Identification of an ATP-binding RNA in the intron of IGF1R pre-mRNA（IGF1R前体mRNA内含子中ATP结合RNA的鉴定）

基因组定位分析显示，ATPseq1精确匹配人类15号染色体胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）基因第1号内含子的41个碱基对区域（chr15:98,664,601–98,664,641; GRCh38/hg38）。该序列包含一个（UGGAGGU）₄的简单串联重复序列，且3'端的9个核苷酸属于AluSx短散在核元件（SINE）。测序结果完美匹配参考基因组，排除了突变或扩增错误的可能性。

4. Confirmation of the ATP-binding RNA（ATP结合RNA的验证）

为了排除接头序列的影响，研究人员合成了不含接头的41 nt全长ATPseq1进行验证。ATP亲和柱实验证实，ATPseq1能被ATP特异性洗脱，而已知不结合ATP的对照序列（ATP-40-1 G34C）则不能。定量分析显示，ATPseq1与ATP的解离常数（K_d）约为4.6 mM，这与人类细胞内ATP浓度（4.41 mM）极为接近，表明该RNA可能对细胞内ATP水平的波动敏感。此外，ATPseq1也能被鸟苷三磷酸（GTP）洗脱，但不能被胞苷三磷酸（CTP）或尿苷三磷酸（UTP）洗脱，体现了其对嘌呤的偏好性。

讨论与结论总结

本研究首次从人类转录组中鉴定出一种源自IGF1R基因内含子的内源性非编码RNA，即ATPseq1。该RNA能够形成独特的平行G-四链体结构，并具有特异性的ATP结合能力。其K_d值与生理条件下的细胞内ATP浓度相匹配，提示其可能作为一种天然的ATP感受器参与细胞代谢调控。尽管ATPseq2和ATPseq3同样形成G-四链体，但并不结合ATP，这证明G-四链体结构本身并非ATP结合的充要条件，序列特异性在其中起关键作用。本研究发现的G-四链体RNA具有极高的结构稳定性，不同于以往报道的合成ATP适配体（aptamer）或DNA G-四链体，它代表了自然界中存在的一类新型功能RNA。

在应用层面，RNA纳米颗粒因其良好的肿瘤渗透性、低毒性和高载药量，已成为纳米医学领域的研究热点。然而，现有RNA纳米颗粒常受限于热稳定性不足。本研究发现的ATP结合G-四链体RNA结构紧密、性质超稳，为开发新型RNA纳米材料提供了理想模块。这种材料不仅可以作为药物递送载体，还可作为潜在的疾病治疗靶点，具有重要的生物医学转化价值。未来的研究需要进一步探讨该RNA在体内的生物学功能，以及其在复杂蛋白复合物中是否具备ATP水解酶活性。