Protium heptaphyllum (Aubl.) March. 叶片与果实的植物化学研究及其缩合单宁含量测定

《Results in Chemistry》：Phytochemical study of leaves and fruits and determination of condensed tannins of Protium heptaphyllum (Aubl.) march

Protium heptaphyllum（Burseraceae科，橄榄科）为南美热带地区特有物种，主要分布于巴西，民间俗称为真白布卢（true white breu），传统医学中因其抗炎、镇痛、祛痰及愈合特性而被广泛应用。既往研究多聚焦于其树脂成分，关于植物其他部位的化学组成信息有限。本研究中，研究人员从树皮、叶片及带种子的未成熟果实中提取样品，采用Stiasny法对缩合单宁（condensed tannins, CT）及非单宁化合物进行定量分析，并利用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）技术对果实和树皮的化学成分进行分析。研究结果表明，果实中缩合单宁含量最高，其次为叶片和树皮；而树皮和叶片的Stiasny指数（Stiasny index, SI）较高，提示其提取物中单宁比例相对更高。植物化学分析显示，P. heptaphyllum果实和叶片的水提取物主要由酚类化合物组成，包括奎宁酸（quinic acid）、黄酮类化合物黄杉素（taxifolin）和山柰酚（kaempferol）及其衍生物，这些化合物此前尚未见文献报道。因此，该提取物显示出未来药理学研究的潜力。

研究背景与目的

Protium heptaphyllum（Aubl.）March. 属于橄榄科（Burseraceae）植物，分布于南美洲热带地区，主要见于巴西的亚马逊、卡廷加、塞拉多及大西洋森林等生物群系。该物种在民间医学中应用广泛，其叶片和树脂被用作抗炎、镇痛、祛痰和愈合剂，树脂还被当地社群用于制作清漆、船用木材密封剂、薰香及驱虫剂等。既往文献大量聚焦于其树脂成分，如五环三萜类化合物α-香树脂醇（α-amyrin）和β-香树脂醇（β-amyrin）、三萜类化合物brein、maniladiol等，而对植物其他部位的化学组成研究匮乏。特别值得注意的是，尚无研究涉及通过回流煎煮法获取的单宁提取物及其糖类、矿物质和有机酸等成分。植物单宁（tannins）作为天然多酚类化合物，在果蔬、谷物和种子中广泛存在，具有抗菌、抗病毒、酶抑制、抗氧化、抗突变及抗肿瘤等多种生物活性。为填补这一知识空白，研究人员采用去重复化（dereplication）策略，结合UPLC-MS/MS技术，对P. heptaphyllum不同部位的缩合单宁进行定量，并对叶片和果实的水提取物进行化学表征，以期为后续药理活性研究提供基础数据。该论文发表于《Results in Chemistry》。

关键技术方法

本研究用到的主要技术方法包括：（1）Stiasny法——用于缩合单宁含量（condensed tannin content, CTC）及非单宁化合物含量（non-tannin compound content, NTC）的定量测定，通过甲醛在酸性条件下与单宁反应生成沉淀，计算Stiasny指数（SI）及总固形物含量（total solid content, TSC）；（2）UPLC-MS/MS联用技术——采用Waters ACQUITY UPLC液相色谱系统，配备BEH C-18色谱柱（1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm），以水和乙腈为流动相进行梯度洗脱，串联Waters Xevo G2-XS QTof/Tof质谱仪，在负离子模式下进行检测，质谱条件包括电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）源、毛细管电压2.5 kV、锥孔电压40 V、源温度100 °C、脱溶剂温度350 °C、碰撞能量25–45 V等，用于鉴定和注释水提取物中的化学成分；（3）样本队列来源——植物材料于2018年7月采自巴西北里奥格兰德（Rio Grande do Norte）州马卡伊巴（Macaíba）市的自然种群，凭证标本存放于北里奥格兰德联邦大学植物标本馆（馆藏号26577），并在国家遗传遗产和传统知识管理系统（SisGen）登记（编号AF83CE4）。

研究结果

单宁定量分析结果

研究人员对树皮、叶片和果实的单宁提取物进行了系统定量分析。结果显示，总固形物含量（TSC）以果实最高（32.20% ± 3.51%），其次为叶片（15.53% ± 1.91%）和树皮（8.20% ± 0.92%）。Stiasny指数（SI）反映总提取物中与甲醛反应的物质量，树皮（60.46% ± 1.42%）和叶片（63.62% ± 3.28%）显著高于果实（41.63% ± 4.01%），且树皮与叶片间无统计学差异。缩合单宁含量（CTC）方面，果实最高（13.27% ± 1.59%），叶片次之（9.40% ± 1.04%），树皮最低（5.10% ± 0.78%）；非单宁化合物含量（NTC）亦呈相同趋势，果实达18.93% ± 4.37%，叶片为6.13% ± 1.35%，树皮为3.10% ± 0.15%。研究人员指出，尽管果实CTC绝对值最高，但树皮和叶片具有更高的SI值，表明其提取物中单宁比例更高。与皮革鞣制常用物种Anadenanthera colubrina var. cebil（红安古柯）的树皮（CTC 13.95%，TTC 9.35%，SI 59.85%）相比，P. heptaphyllum果实单宁含量更高，而树皮和叶片较低。鉴于该物种为雌雄异株，仅雌株结果且田间结果率低，果实获取存在困难；树皮虽单宁含量可观，但其有机化合物多投资于树脂生产；叶片则因全年可获取而成为较为可行的商业化替代来源。

果实与叶片水提取物的植物化学评价

研究人员通过UPLC-MS/MS在负离子模式下对水提取物进行成分分析，从果实和叶片水提物中鉴定并注释了12种化合物。化合物01鉴定为奎宁酸（quinic acid, QA，C?H??O?，分子量192 Da），为两种提取物色谱图中的主要成分，其去质子化分子离子为m/z 191 [M–H]?，MS2产生m/z 127、111、93等特征碎片离子，此为该物种中首次报道。化合物02鉴定为绿原酸（chlorogenic acid，C??H??O?，分子量354 Da），m/z 353 [M–H]?经MS2产生m/z 191（咖啡酰基中性丢失162 Da）和m/z 271等碎片。化合物03在果实中Tr 2.46 min检出，m/z 315 [M–H]?产生m/z 299（甲基丢失）和m/z 285（甲醛丢失）等碎片，鉴定为3-O-甲基鞣花酸（3-O-methyl-ellagic acid），亦为该物种首次报道。化合物04在叶片和果实中均有检出，m/z 371 [M–H]?及加合离子m/z 743，MS2产生m/z 249、121、111等碎片，鉴定为3-(3,4-二羟基苯基)乳酸2-O-奎宁酸酯。化合物05在叶片中Tr 7.08 min检出，m/z 300.99 [M–H]?及加合离子m/z 602.99，MS2产生m/z 270.99和m/z 150.98等槲皮素（quercetin）特征碎片。化合物06在果实中Tr 5.04 min检出，m/z 447 [M–H]?，产生m/z 301（鼠李糖中性丢失146 Da）和m/z 271等碎片，鉴定为槲皮素-3-O-β-鼠李糖苷（quercetin-3-O-β-rhamnoside）。化合物07和08分别在果实和叶片中Tr 8.47 min检出，前者m/z 285 [M–H]?鉴定为山柰酚（kaempferol），后者m/z 417 [M–H]?产生m/z 285（戊糖基中性丢失132 Da），鉴定为山柰酚-3-O-戊糖苷。化合物09在叶片中Tr 4.61 min检出，呈现m/z 899二聚体和m/z 1349三聚体加合离子，m/z 449 [M–H]?产生m/z 303、285、151等碎片，鉴定为黄杉素-3-O-鼠李糖苷（taxifolin-3-O-rhamnoside）。研究特别指出，黄杉素（taxifolin）、山柰酚（kaempferol）及其衍生物此前尚未在P. heptaphyllum中报道。质量精度误差（ppm）分析显示多数化合物偏差较高，研究人员归因于基质复杂性、共洗脱效应及加合物形成，建议后续采用标准品对照及互补分析技术进行确证。

讨论与结论

研究结果表明，P. heptaphyllum的化学多样性与高等植物单宁生物合成的标准代谢途径密切相关。酚类化合物的生物合成主要通过莽草酸途径（shikimic acid pathway）和甲羟戊酸途径（mevalonic acid pathway）进行，奎宁酸、糖类及多种多元醇作为单宁构建单元参与反应。单宁化学上分为可水解单宁（hydrolysable tannins, HT）和缩合单宁（condensed tannins, CT）两类，前者在酸或酶作用下水解为没食子酸、奎宁酸、焦儿茶酸和糖类等，后者则为黄烷-3-醇（flavan-3-ol）等黄酮单元通过碳-碳键连接的寡聚体或聚合物，对水解降解具有抗性。本研究鉴定的黄酮类化合物与既往文献报道的P. heptaphyllum叶片乙醇提取物中槲皮素-O-β-D-葡萄糖苷、杨梅素（myricetin）和槲皮素等黄酮类成分相一致，支持了该物种的抗氧化活性与其酚类成分相关的推测。

本研究结论如下：P. heptaphyllum的植物器官类型显著影响提取物产量及化合物组成；果实为缩合单宁含量最高的结构（13.27 ± 1.59%），其次为树皮和叶片，提示其在单宁生产方面具有开发潜力；所有分析部位均表现出令人满意的Stiasny指数，为后续研究奠定基础。本工作通过UPLC-MS/MS去重复化技术，在P. heptaphyllum果实和叶片中注释鉴定了9种化合物，证实了黄酮类、奎宁酸衍生物及鞣花酸等酚类代谢物的存在，后者属于可水解单宁。其中多种化合物为该物种首次报道。鉴于目前关于P. heptaphyllum果实和叶片的信息匮乏——与树皮树脂的广泛研究形成鲜明对比——本项初步工作为该物种的化学轮廓提供了前所未有的数据，拓展了现有认知并激发了未来研究兴趣。此外，本研究表明应对其生物活性，特别是抗氧化潜力进行更深入的评估，并探索可能的提取物制备新方法。