《Small Science》：Nanomicelle-Based Multi-mRNA Delivery Promotes Cardiac Repair After Myocardial Infarction
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心肌梗死（MI）后的病理性重塑涉及多因素机制，凸显了组合治疗策略的必要性。合成mRNA具有设计灵活性，是实现此类方法的理想模式。为探究该策略，研究人员从一种模型中选取了五个基因（Hgf、Igf1、Pdgfb、Cxcl12和Tgfβ1），在该模型中，人诱导多能干
心肌梗死（MI）后的病理性重塑涉及多因素机制，凸显了组合治疗策略的必要性。合成mRNA具有设计灵活性，是实现此类方法的理想模式。为探究该策略，研究人员从一种模型中选取了五个基因（Hgf、Igf1、Pdgfb、Cxcl12和Tgfβ1），在该模型中，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）分泌的外泌体（EVs）可恢复心脏功能。研究人员通过直接心肌内注射的方式，将编码这些基因的合成mRNA以聚阳离子纳米胶束（polyplex nanomicelle）为载体递送至MI诱导的心力衰竭小鼠体内。纳米胶束已被证实可实现稳定包封、增强局部表达并延长滞留时间。该治疗通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-ETS转录因子4（ETV4）轴促进血管生成，通过抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）/叉头框蛋白O3（FOXO3）通路抑制纤维化，并通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路增强修复，从而产生包括组织再生、收缩功能改善和存活期延长在内的多方面获益。这些发现确立了多基因mRNA鸡尾酒疗法对MI后心力衰竭的治疗潜力，并为开发针对以复杂重塑为特征的疾病的干预措施迈出了重要一步。
心肌梗死（MI）是全球首要死亡原因，其进展为缺血性心肌病带来了日益沉重的死亡负担，凸显了新型治疗策略的迫切需求。目前，早期再灌注仍是限制梗死范围的唯一确立干预手段，但尚无有效疗法针对随后的病理性重塑，包括心室扩张和收缩功能障碍。该重塑机制涉及多因素过程，包括缺血损伤触发的炎症、纤维化等，单一干预难以实现显著获益。细胞移植和细胞外囊泡（EV）给药主要通过组合性旁分泌效应发挥作用，但缺乏标准化阻碍了其临床应用。近年来，mRNA技术发展为广泛适用的治疗平台，在缺血性心脏病中，心肌内直接递送血管内皮生长因子（VEGF）mRNA可刺激血管生成并改善动物模型心脏功能，但临床试验仅证实安全性而功能获益有限，导致研发中止。
研究人员先前已证实，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）分泌的EV可改善心脏病模型的心脏功能，且治疗后心肌中多个基因呈快速瞬时诱导表达，提示多种修复因子同时递送可能协同增强恢复。基于此，研究人员利用mRNA这一易于工程化且适合同步递送的模态，在MI动物模型中评估功能恢复。候选基因通过分析细胞移植和EV治疗缺血性心脏病的修复过程确定，重点关注治疗后快速瞬时诱导的基因。为确保mRNA心肌递送的安全性，研究人员采用聚阳离子纳米胶束载体，该载体为聚乙二醇（PEG）与聚胺的嵌段共聚物自组装纳米颗粒，可稳定包封mRNA。与广泛用于mRNA疫苗的脂质纳米颗粒（LNP）不同，纳米胶束直径仅数十纳米，表面近乎中性并包裹致密PEG外壳，可实现局部mRNA递送而不引发给药部位免疫激活，其安全性和效率已在肌肉、关节、神经系统等多个器官得到验证。
研究人员首先基于临床级hiPSC-CM来源的EV治疗大鼠MI后心力衰竭模型，通过超速离心法从培养基中收集EV，对治疗后心肌组织进行RNA测序，从第3天显示强瞬时上调的基因中选取候选因子。最终确定Hgf、Igf1、Pdgfb、Cxcl12和Tgfβ1五个基因：HGF促进组织损伤后细胞保护和血管生成；IGF1支持心肌细胞代谢和收缩功能；PDGF-B促进免疫细胞募集和新形成血管的稳定；CXCL12促进造血干/祖细胞募集至损伤心肌；TGFβ1抑制过度免疫反应并发挥促修复的抗炎效应。
为验证mRNA的蛋白表达，研究人员通过体外转录（IVT）制备合成mRNA，使用N1-甲基伪尿苷-5'-三磷酸修饰以提高稳定性和降低免疫原性，Western blotting证实各因子 robust 蛋白表达。载体方面，合成PEG-PAsp(DET)嵌段共聚物，与mRNA按N/P比3.0混合形成直径约90 nm的聚阳离子纳米胶束，该比例可确保形成稳定电荷匹配的纳米胶束。
在体实验采用10周龄雌性C57BL/6J小鼠，通过左冠状动脉结扎诱导MI，1周后超声心动图筛选左心室射血分数（LVEF）<50%的小鼠纳入研究。将1 μg各mRNA纳米胶束、裸mRNA或PBS心肌内注射至梗死边界区，分别于治疗后2周和4周进行心功能评估，长期生存分析至250天。
结果显示，纳米胶束封装显著增强并延长心脏mRNA表达。荧光素酶（Luc）mRNA纳米胶束给药后各时间点表达均高于裸mRNA，第7天降至峰值约10%但仍持续至第13天，而裸mRNA第7天已检测不到。离体器官分析显示，纳米胶束主要局限于心脏注射部位，肺、肝、脾、肾、卵巢等非靶器官表达极低，且未见炎症细胞浸润或组织学损伤，血浆炎症因子（IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12p70、TNF-α）无升高，肝肾功能指标正常。增强绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA纳米胶束的心肌细胞特异性表达分析显示，EGFP表达于心室肌肌钙蛋白T（cTnT）阳性心肌细胞，而不表达于波形蛋白（Vimentin）阳性成纤维细胞、CD31阳性内皮细胞或α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性平滑肌细胞。
五因子mRNA纳米胶束治疗显著改善MI后心力衰竭小鼠生存率，与Luc mRNA纳米胶束和PBS对照相比，Kaplan-Meier生存曲线显示显著获益。代表性M型超声显示对照组前壁持续运动消失，而五因子组壁运动恢复。定量分析显示，五因子组前壁变薄在2周时减轻并维持至4周，后壁厚度各组无显著差异。五因子组病理性左心室扩张在收缩期和舒张期均减轻，LVEF和缩短分数（FS）较对照改善。
组织学分析显示，五因子组天狼星红染色梗死面积小于对照组，边界区纤维化显著抑制，远程区无差异。CD31染色显示五因子组边界区血管密度增加，远程区无变化。TUNEL阳性细胞数减少，表明心肌细胞凋亡受抑。
转录组学分析揭示五因子治疗重塑五个标志通路。主成分分析（PCA）显示五因子组与对照组转录谱明显分离。DESeq2鉴定出1,011个上调和1,058个下调差异表达基因（DEGs），外源五因子mRNA均为表达量最高的基因之一。Reactome基因集分析（ReactomeGSA）显示五因子组核糖体RNA相关RNA代谢、细胞周期、DNA复制、DNA修复显著激活，而线粒体相关代谢在对照组富集。基因集富集分析（GSEA）支持上述发现。
基因网络分析揭示五特征通路的分子机制。力导向布局显示对应五基因集的明显聚类。转录调控因子分析鉴定出关键因子：ETV4关联RNA代谢；E2F1关联细胞周期、DNA复制和DNA修复；PPARA关联代谢通路。前50个枢纽基因包括Src、Mapk3、Fos（ERK相关）、Jun（JNK相关）及PI3K负调节因子Pik3r1。值得注意的是，单因子给药时这些基因变化有限，而五因子联合应用时效应显著增强。
综合模型显示：ERK和PI3K激活，ETV4刺激RNA代谢，E2F1激活细胞周期、DNA复制和DNA修复；PPARα-Sirt1复合物激活被抑制，该复合物既往报道可抑制线粒体基因表达并促进心力衰竭病理发生。对照组Ppara和Sirt1升高而五因子组受抑，提示JNK通路抑制贡献于此效应。
讨论部分，研究人员指出这是首个证实多基因mRNA鸡尾酒可改善心肌梗死后重塑的体内研究。RNA-seq分析揭示MEK-ERK-ETV4/E2F1和PI3K-Akt-ETV4轴激活，以及JNK-AP1-PPARA轴抑制，与病理性重塑的核心机制一致，包括心肌细胞存活、血管生成和纤维化调控。虽然单次给药的蛋白表达仅持续约2周，但心功能改善维持至少4周，与既往研究一致，表明mRNA治疗可能通过瞬时激活早期修复反应（包括炎症调节、抑制心肌细胞死亡和促进血管生成），继而减轻不良左心室重塑。
PI3K-Akt-ETV4轴激活是 coupling 血管生成与心脏保护的核心机制。PI3K-Akt通路是MI后修复的关键调节因子，涉及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、VEGF、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等下游效应分子，驱动细胞增殖、血管生成和心肌细胞存活。五因子治疗同时激活转录因子ETV4，其已知调节RNA代谢和促血管生成基因程序。组织学分析显示梗死边界区CD31阳性血管增加，直接将通路激活与结构改善联系起来。
FOXO3是PI3K-Akt通路的关键下游效应分子，上调时加重MI后重塑。作为转录因子，FOXO3驱动凋亡和纤维化，而其抑制具有心脏保护作用。本研究中对照组Foxo3表达显著升高，而五因子治疗通过Akt信号抑制其表达。组织学显示边界区纤维化显著减少，直接将FOXO3抑制与纤维化减轻、心室结构保留和收缩功能维持联系起来。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联包括ERK、JNK、p38和ERK5四个分支，调控心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的增殖分化。其中ERK通路参与心肌修复和存活，五因子治疗诱导其激活。特别值得注意的是转录因子E2F1的诱导，其为细胞周期进程、DNA复制和DNA修复的主调节因子。RNA-seq显示E2F1驱动程序富集，表明心肌再生基本转录网络的再激活。
JNK通路抑制和PPARα-Sirt1轴调节是另一关键发现。JNK级联促进心肌细胞凋亡、炎症和纤维化，RNA-seq证实其受抑制。PPARα是调控脂质代谢和线粒体功能的核受体，过度激活时引发心力衰竭代谢紊乱。对照组Ppara和Sirt1表达升高，而五因子治疗抑制其诱导，表明五因子疗法通过JNK抑制减弱PPARα-Sirt1轴的适应性不良激活，从而保全线粒体稳态和能量代谢稳定，贡献于衰竭心脏的结构保留和功能恢复。
这些通路通过交互串扰汇聚：Akt增强血管生成和存活，ERK-E2F1激活修复通路，JNK抑制减轻纤维化，PPARα-Sirt1轴调节稳定代谢。其整合活性遏制病理性重塑，产生心脏功能和存久的持久改善。
递送系统特性是该策略成功的关键。虽然LNP-mRNA技术的进展扩展了mRNA药物的治疗适用性，但LNP诱导的炎症可显著降低mRNA治疗效果。LNP在疫苗环境中通过佐剂样效应诱导强烈免疫反应，但这一特性在心脏修复等治疗场景中可能不利，因为过度炎症是有害的。尽管干细胞或祖细胞来源的EV作为心血管疾病治疗剂备受关注，但其临床应用受限于 cargo 异质性和复杂作用机制。EV和合成纳米颗粒递送系统存在低免疫原性与高效递送（包括内涵体逃逸）之间的权衡。聚阳离子纳米胶束旨在平衡这些 competing 约束，既往已在骨骼肌、关节软骨、脑和脊髓证实可诱导 strong 局部mRNA表达且有限免疫激活，本研究首次将其应用于心脏，实现稳定包封、增强和延长的心脏表达。与直接心脏给药后仍有显著脱靶蓄积于肝脏、脾脏和肺的LNP不同，纳米胶束主要将表达限制于给药部位的心肌细胞。
研究结论部分指出：本研究首次提供体内证据，表明使用mRNA的多基因表达策略可有效调节心脏MI后重塑。PI3K-Akt-ETV4轴的协调激活促进血管生成，JNK/FOXO3通路抑制限制纤维化，ERK通路激活增强修复，共同驱动组织再生、改善心脏功能并延长生存。聚阳离子纳米胶束的特性作为该策略的关键基础，实现高效递送和持续表达。这些发现凸显了mRNA鸡尾酒疗法在MI后心力衰竭复杂病理环境中的治疗潜力，并代表了向新治疗选择迈出的重要一步。
