《Toxicology》：Identification of estrogenic and DNA damaging chemicals using a combined morphological and genotoxic biomarker assay
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当前化学品风险评估的核心挑战之一在于整合多种基于体外实验的新方法学（New Approach Methodologies, NAMs），以构建下一代风险评估（Next-Generation Risk Assessment, NGRA）体系。其中，识别非遗传毒性
当前化学品风险评估的核心挑战之一在于整合多种基于体外实验的新方法学（New Approach Methodologies, NAMs），以构建下一代风险评估（Next-Generation Risk Assessment, NGRA）体系。其中，识别非遗传毒性致癌物（Non-Genotoxic Carcinogens, NGTxC）尤为困难，因其致癌机制不依赖于对基因组完整性的直接破坏，而是通过多种细胞通路介导。为限制所需实验总数，在同一测试系统中联合反映不同机制的检测指标至关重要。本研究对先前建立的、基于人乳腺癌MCF-7细胞系的E-Morph筛选试验（E-Morph Screening Assay, ESA）进行了扩展，使其可同时检测DNA损伤，从而区分遗传毒性与经核受体介导的非遗传毒性致癌物。为评估该扩展试验的性能，研究人员构建了一个包含遗传毒性和非遗传毒性致癌模式化合物的化学品库，并在100 μM起始浓度下设置6个不同浓度进行处理。同时，研究人员在表达部分代谢活性的肝肿瘤细胞系HepG2中，采用γH2AX/磷酸化组蛋白H3（pH3）遗传毒性检测方法对相同化合物进行了测试。结果显示，两种细胞系在检测遗传毒性效应方面表现出强相关性。此外，研究人员观察到在MCF-7细胞中，γH2AX诱导水平与雌激素受体（Estrogen Receptor, ER）激动活性呈强相关性，而在HepG2细胞中则与诱发非整倍体性（aneugenicity）相关。综上所述，扩展后的ESA是一种极具前景的新型NAM，有望在未来的NGRA中发挥重要作用，用于识别和表征致癌危害。
研究背景与目的
随着欧盟“化学品风险评估伙伴关系”（PARC）项目的推进，开发能够覆盖复杂毒理学终点的新方法学成为下一代风险评估的核心任务。癌症作为复杂的生物学终点，其发生涉及癌细胞特征（Hallmarks of Cancer）中列出的多种能力，如持续增殖信号、激活侵袭与转移及基因组不稳定性等。目前，监管层面的致癌性分类主要依赖动物实验，耗时耗力且物种差异显著。特别是针对非遗传毒性致癌物的识别，现有的体外标准试验组合（如细菌回复突变试验、染色体畸变试验等）往往无能为力，因为这类物质不直接损伤DNA，而是通过受体介导、慢性炎症、氧化应激等机制促癌。因此，开发能够在体外有效区分遗传毒性与非遗传毒性致癌物，特别是结合内分泌干扰效应的高通量筛选工具，具有重要的科学意义和监管需求。基于此，德国联邦风险评估研究所的研究人员开展了一项研究，旨在通过扩展已有的E-Morph筛选试验，构建一个能够同时检测雌激素受体激动活性和DNA损伤的多终点检测平台。
关键技术方法
研究人员首先构建了一个包含72种化学品的测试库，涵盖已知的遗传毒性致癌物、非遗传毒性致癌物及阴性对照。核心实验采用了稳定表达E-钙粘蛋白-绿色荧光蛋白（E-Cad-GFP）的人乳腺癌MCF-7细胞系。技术路线主要包括两个层面：一是利用E-Morph筛选试验检测雌激素受体（ER）活性，通过在竞争性拮抗环境下量化细胞膜区域GFP荧光强度的变化来评估ER激动效应；二是整合γH2AX免疫荧光染色技术检测DNA双链断裂。研究分别在给药后24小时和48小时两个时间点采集数据，并利用高内涵成像系统进行定量分析。为了验证结果的普适性，研究人员同时在人肝癌HepG2细胞系中采用了已建立的γH2AX/pH3检测法进行对比。数据分析采用了三种统计学策略（平均强度法、95百分位阳性细胞百分比法、焦点计数法）来评估遗传毒性，并严格设定了细胞毒性阈值以排除假阳性。
研究结果
3.1 工作流程构建
研究人员成功建立了一套联合检测流程，能够在单次实验中同步获取雌激素受体激活、DNA损伤及细胞毒性三个维度的数据。该流程利用MCF-7细胞在48小时处理后进行形态学分析和γH2AX染色，同时在24小时增设早期遗传毒性检测点，兼顾了直接DNA损伤和继发于细胞增殖的间接效应。
3.2 化学品雌激素受体激动活性评估
通过对72种化学品的筛选，研究人员识别出10种具有潜在ER激动活性的化学物质。经数据库比对和验证，确认了17α-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、己烯雌酚、异炔诺酮和4-叔戊基苯酚为已知ER激动剂。此外，研究发现苯扎氯铵和CDDO-Me为潜在的新型ER激动剂，尚需进一步验证。研究指出，E-Morph筛选试验对于中强效雌激素检测灵敏度高，但对于极弱效激动剂（如开蓬、p,p'-DDD）可能因溶解度或细胞毒性限制而出现漏检。
3.3 乳腺癌细胞模型中DNA损伤效应评估
研究人员比较了三种γH2AX数据分析策略。结果表明，基于95百分位阈值的阳性细胞百分比法（Strategy 2, %POS）在24小时时间点最为灵敏，能有效检出苯并[a]芘、依托泊苷、吲哚[1,2,3-cd]芘等已知遗传毒物。在48小时时间点，%POS法与焦点计数法（Strategy 3, FOCI）检出率相当。值得注意的是，部分ER激动剂（如己烯雌酚、17α-乙炔雌二醇、17β-雌二醇）在48小时显示出显著的γH2AX升高，提示其可能通过诱导次级遗传毒性（如促进细胞增殖导致复制错误积累）发挥作用。
3.4 肝细胞与乳腺癌细胞模型DNA损伤检测的比较及文献关联
将MCF-7细胞与HepG2细胞的检测结果进行对比，去除仅表现为非整倍体性（由pH3标记指示）的化学物质后，两种细胞系在检测DNA断裂（Clastogenic）方面的重叠率高达90%。与文献数据的相关性分析显示，MCF-7细胞模型的敏感性为59.1%，特异性为97.6%；而HepG2模型若仅使用γH2AX指标，敏感性较低，但若结合pH3指标（用于检测非整倍体性），敏感性可提升至90.5%，特异性保持在97.2%。
3.5 内分泌活性与遗传毒性的相关性
研究发现最强的ER激动剂（17α-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、己烯雌酚）在MCF-7细胞中均表现出显著的48小时次级遗传毒性。有趣的是，这些化合物在HepG2细胞中于24小时表现出非整倍体性效应，且其有效浓度远高于其在MCF-7中诱导雌激素效应的浓度。这暗示强效雌激素可能首先在肝脏细胞中引起染色体分离异常（非整倍体性），进而在长期暴露的乳腺组织中通过促进增殖导致继发性DNA损伤。
讨论与结论
讨论部分指出，扩展后的E-Morph筛选试验（ESA）有效整合了形态学与遗传毒性终点，符合3R原则，减少了动物实验需求。研究人员推荐在未来的应用中重点关注基于95百分位阈值的分析策略，以提高检测灵敏度。研究证实，该试验不仅能检测直接的DNA损伤，还能捕捉到由ER激活引发的、与细胞增殖相关的晚期遗传毒性效应。这种跨细胞模型的关联性为理解激素依赖性致癌机制提供了新视角。
结论部分强调，该研究开发的扩展ESA是一种结合了雌激素活性检测与DNA损伤生物标志物检测的联合方法。它能够在一个统一的人源细胞背景下，同步评估与致癌性密切相关的两个关键体外终点。鉴于监管机构对兼具内分泌干扰和遗传毒性特征的化学物质高度关注，该扩展ESA作为一种高性能的新方法学，有望被纳入下一代风险评估框架，并成为构建致癌性综合测试评估策略的重要组成部分。
