U-SENS?检测方法在评估农用化学品活性成分及制剂皮肤致敏潜力方面的适用性

《Toxicology》：Applicability of the U-SENS? assay for assessing skin sensitization potential of agrochemical active ingredients and formulations

Mariela Lenze|Martina Daniela Benedetti|Mora Renée García|Juan Ignacio Pina|Silvia Wikinski|María Laura Gutiérrez

布宜诺斯艾利斯大学药理学研究所，Paraguay街2155号，布宜诺斯艾利斯C1121ABG，阿根廷

引言

全球范围内使用农用化学品来提高作物产量并满足食品生产需求。它们由一种或多种活性成分（AIs）与表面活性剂、溶剂、载体和粘合剂等附加成分组合而成（Ware和Whitacre，2004年）。此外，不同类型的制剂（如可溶浓缩物、乳化浓缩物、润湿性粉末和颗粒）增加了其安全性评估的复杂性。

根据联合国《全球化学品统一分类和标签制度》（UN GHS），监管机构要求对农用化学品的活性成分及其制剂进行皮肤致敏性测试，作为急性毒性“六项组合”测试的一部分（Daniel等人，2018年）。该测试的 hazard 分类基于动物数据，将物质分为I类（致敏剂）或非致敏剂（联合国，2021年）。

豚鼠是最早用于评估致敏潜力的动物模型。目前，只有两种方法——Buehler测试和豚鼠最大化测试（GPMT）——被OECD TG No. 406认可（OECD，2022年）。然而，这些方法因动物福利问题（例如，使用的动物数量多和反应严重）以及预测性能的局限性（包括敏感性变化、假阳性和假阴性结果以及操作者的主观性）而受到批评（Basketter等人，1998年；Basketter和Kimber，2010年）。

作为一种改进和替代方法，局部淋巴结测定（LLNA）在OECD TG No. 429下被开发并采用（OECD，2010年）。这种定量方法测量啮齿动物暴露于潜在过敏原后淋巴结中的淋巴细胞增殖情况。尽管LLNA相比豚鼠测试具有优势，但它也存在一些公认的局限性：（1）某些金属和临床相关过敏原的假阴性结果；（2）已知刺激物的假阳性结果；（3）物种间差异，因为啮齿动物的皮肤渗透性和代谢途径与人类不同（Anderson等人，2011年；NIH，2011年；Roberts等人，2016年；Roberts和Api，2018年）。

在适当的情况下，仍会使用体内研究，这取决于行业部门和监管框架（Daniel等人，2018年）；然而，关于动物实验对人类健康相关性的伦理和科学担忧推动了非动物替代方法的发展。由于皮肤致敏机制已经得到充分研究，因此建立了一个包含四个关键事件（KEs）的不良后果路径（AOP）（OECD，2012年）。已经开发并验证了一系列标准化的化学和体外测试方法来评估前三个KEs，例如：（1）直接肽反应性测定（DPRA；OECD TG 442C）（OECD 2025b），用于测量半抗原与皮肤蛋白的结合；（2）KeratinoSens?（OECD TG 442D）（OECD 2024a），用于模拟角质形成细胞的炎症反应；（3）人类细胞系激活测试（h-CLAT）和U-SENS?（OECD TG 442E）（OECD 2024b），用于评估树突状细胞（DC）的激活；以及（4）T细胞增殖。此外，生物激活在半抗原化过程中起着关键作用，因为半抗原在酶促转化（prohaptens）或空气氧化（prehaptens）后可能对皮肤蛋白产生反应（G?tz等人，2012年；G?tz等人，2012年；Oesch等人，2014年）。这些测试方法可以整合到一个标准化的、无需专家判断的数据解释框架中，即定义的方法（DA），以实现可靠的分类（OECD TG No. 497）（OECD 2025a）。

有足够的科学证据支持亲电性过敏原与皮肤蛋白中的亲核氨基酸残基之间的特定共价相互作用，以及可能导致蛋白质反应的自由基形成机制（Ahlfors等人，2003年；Aleksic等人，2009年；Chipinda等人，2010年；Chipinda等人，2014年；Meschkat等人，2001年）。这些见解使得能够开发出计算模型，以识别目标分子中的蛋白质结合警报（PBAs）。

两种体外测试方法用于评估与人类单核细胞中DC激活相关的细胞表面标记物：U-SENS?测量U937细胞中的CD86诱导，而h-CLAT测量THP-1细胞中的CD86和CD54表达。

这些替代方法在农用化学品中的应用仍然有限（Leme等人，2025年；Seifert等人，2025年；Settivari等人，2015年；Strickland等人，2022年；Yang等人，2023年），特别是U-SENS?测试在这些化学品产品上的性能尚未得到评估。为了填补这一空白，本研究旨在评估U-SENS?测试在一组农用化学品（包括活性成分及其商业制剂）上的预测性能，并通过计算机模拟识别PBAs来补充这一分析，考虑生物和非生物转化，以提供U-SENS?测试结果的机制支持。

部分摘录

农用化学品测试物质特性

活性成分（表1）及其相应的商业制剂（表2）由ATANOR S.C.A.提供。选择这些物质是基于测试材料的可用性，并确保致敏剂和非致敏剂的平衡代表，尽管获得具有致敏作用的制剂特别具有挑战性。该公司之前进行的体内研究是在保密协议下使用Buehler测试进行的

U-SENS?的预测性能

所测试的农用化学品没有出现溶解度或化学稳定性问题，如沉淀或相分离，也没有观察到荧光干扰。90%的测试（20次中的18次）符合所有接受标准，在一次测试中，由于乳酸导致S.I.超过150%，反应性检查失败。

图1显示了每种测试物质的剂量-反应曲线，区分了无反应的化合物和诱导CD86激活的化合物。

讨论

U-SENS?测试针对皮肤致敏的AOP中的KE3，即树突状细胞激活。其在复杂混合物（如农用化学品制剂）中的性能尚未得到充分探索。因此，我们研究了U-SENS?测试是否能够可靠地评估制剂产品及其活性成分，并通过计算机模拟预测PBAs和潜在的生物激活途径来补充这些结果。

U-SENS?测试对制剂的总体准确率为72%

结论

从方法论的角度来看，使用U-SENS?测试评估制剂和活性成分是可行的。在溶解度或荧光测量干扰方面没有遇到问题。获得的性能指标与其他类型物质在U-SENS?测试中的结果以及使用h-CLAT测试评估的农用化学品的结果相当。这可能表明在某些情况下，U-SENS?测试比h-CLAT更适用

缩写

本手稿中使用了以下缩写

CRediT作者贡献声明

María Laura Gutiérrez：撰写——原始草稿，监督，资源管理，项目协调，资金获取，正式分析，概念构思。Mariela Lenze：撰写——原始草稿，方法学研究，数据整理，概念构思。Juan Ignacio Pina：正式分析。Silvia Wikinski：撰写——原始草稿，资金获取，正式分析。Martina Daniela Benedetti：撰写——原始草稿，正式分析。Mora Renée García：撰写——原始草稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢来自戈亚斯联邦大学药学院体外毒理学教育与研究实验室（Tox In）的Marize Campos Valadares博士和Artur Christian Garcia da Silva博士在U-SENSTM测试方面的培训。

本研究由布宜诺斯艾利斯大学（UBACYT 20020170100017）和阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）（PIP 2021 – 11220200102369CO）资助