《Translational Oncology》：Multi-Omics profiling identify NNMT in tumor endothelium as a key regulator of CD8? T cell exhaustion via the TGF signaling pathway
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烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT)是一种关键调控酶，通过催化烟酰胺（NAM)的甲基化反应，利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，生成1-甲基烟酰胺（1-MNA)，进而参与NAD?挽救通路。研究表明，NNMT在肾透明细胞癌（ccRCC)肿瘤内皮细胞中的异常高
烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT)是一种关键调控酶，通过催化烟酰胺（NAM)的甲基化反应，利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，生成1-甲基烟酰胺（1-MNA)，进而参与NAD?挽救通路。研究表明，NNMT在肾透明细胞癌（ccRCC)肿瘤内皮细胞中的异常高表达与CD8? T细胞耗竭存在显著关联。基于多组学整合分析结合人工智能（AI)驱动的靶点预测模型，本研究识别出NNMT作为ccRCC免疫代谢调控的核心节点。通过批量RNA测序（bulk RNA-seq)、单细胞RNA测序（scRNA-seq)及空间转录组学技术，系统解析了NNMT高表达区域与T/NK细胞耗竭、促凋亡信号活化及免疫抑制性细胞因子分泌之间的空间共定位特征。功能验证层面，利用Caki-1和A-498细胞系构建NNMT敲低模型，通过CCK-8细胞活力检测、Transwell迁移侵袭实验、ELISA检测白细胞介素-6（IL-6)、白细胞介素-1β（IL-1β)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α)及TGF-β通路活性，证实NNMT缺失可抑制肿瘤细胞增殖迁移、降低促炎因子水平，并通过调控BAX/Bcl-2比值及活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3)促进凋亡。体内皮下瘤模型结合流式细胞术显示，NNMT敲低显著恢复CD8? T细胞浸润及效应功能。此外，基于PRISM算法预测I-BET-762、I-BET-151、PFI-1及BMS-387032等分子可通过靶向NNMT-TGF-β轴减轻CD8? T细胞耗竭。
肾透明细胞癌（ccRCC)作为一种高度免疫原性肿瘤，其肿瘤微环境（TME)内CD8? T细胞的功能耗竭构成了免疫治疗耐药的核心瓶颈。传统认知中，T细胞耗竭主要表现为效应分子肿瘤坏死因子-α（TNF-α)和干扰素-γ（IFN-γ)的持续下调、多种共抑制受体的持久过表达、线粒体代谢功能障碍及丝裂原相关表观遗传重编程。近年来，代谢重编程在重构免疫抑制性TME及诱发T细胞耗竭中的主导作用日益凸显，其特征表现为葡萄糖、色氨酸、精氨酸等营养物质的竞争性匮乏，以及乳酸、犬尿氨酸、活性氧（ROS)等肿瘤代谢毒性产物的蓄积。现有研究虽揭示烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT)在肝、乳腺、结肠及肺等多种实体肿瘤中异常高表达且与不良预后密切相关，但NNMT在ccRCC中的具体功能，特别是其在肿瘤血管内皮细胞生物学调控中的作用尚不明晰。
本研究旨在通过整合单细胞与空间多组学数据，结合人工智能驱动的靶点发现策略，系统阐明NNMT在ccRCC免疫代谢调控网络中的核心地位及其分子机制。研究人员首先从TCGA及GEO数据库获取ccRCC转录组数据，将批量转录组高通量测序数据转换为每百万转录本（TPM)格式，并进行去重复和标准化处理；单细胞测序数据来源于GSE159115数据集，采用10× Genomics平台进行测序。空间转录组数据整合GSM5924036、GSM5924040、GSM5924051及GSM5924052四个样本，经联合标准化后进行分析。研究人员运用Seurat软件包（v4.1.0)构建分析对象，设定基因数为200-4000、线粒体基因百分比低于10%的质量控制标准，对数标准化后基于高变基因进行主成分分析（PCA)，并采用均匀流形近似与投影（UMAP)进行降维可视化。细胞间通讯分析采用CellChat R包基于CellChatDB.human数据库预测32条信号轴的相互作用，同时利用Nichenet R包整合蛋白质-蛋白质相互作用（PPI)信息推断配体-受体关系。空间通讯分析采用COMMOT算法实现基于集体最优传输的细胞间通讯推断。非负矩阵分解（NMF)用于从单细胞数据中提取基因表达程序，解析肿瘤细胞的异质性簇群。
在预后模型构建方面，研究人员开发了共识逆正则化最小二乘法（CIRLS)模型，整合10种机器学习算法及101种算法组合，通过差异表达基因（DEGs)筛选、单变量Cox分析、留一法交叉验证（LOOCV)及独立数据集（TCGA-KIRC测试集、ICGC、GSE22541)验证，最终确立NNMT作为ccRCC的关键预后标志物。细胞实验采用中国科学院细胞库来源的人源Caki-1和A-498细胞系，以DMEM培养基（含10%胎牛血清)于37°C、5% CO?条件下培养；通过HiPerFect转染试剂转染5 nM NNMT特异性shRNA（sh-NNMT-1、sh-NNMT-2)及非靶向shRNA阴性对照，24小时后提取总RNA进行实时定量PCR（qRT-PCR)验证敲降效率。功能实验包括：CCK-8细胞活力检测、6孔Transwell迁移侵袭实验、ELISA检测IL-6和IL-1β浓度、细胞划痕实验及克隆形成实验。体内实验选取6-8周龄C57BL/6小鼠，皮下注射1-5×10?个细胞（0.1 ml),每周测量肿瘤体积，最终处死取瘤。免疫浸润分析采用多色流式细胞术，以抗小鼠CD3-PerCP-Cy5.5和抗小鼠CD8-APC抗体标记，经BD LSRFortessa流式细胞仪采集数据，FlowJo v10软件分析。免疫荧光实验中，ccRCC组织切片经脱蜡、水化、柠檬酸缓冲液热修复抗原、0.5% Triton X-100透化、3% H?O?封闭内源性过氧化物酶后，以1:100稀释的兔抗NNMT和兔抗CD3一抗4°C过夜孵育，继而以抗兔二抗孵育2小时，DAPI复染10分钟，激光扫描共聚焦显微镜成像。
研究结果显示，NNMT通过肿瘤炎症区域贯穿TME。空间转录组学分析揭示ccRCC样本中存在显著的细胞异质性：CXCL14参与免疫细胞募集和炎症趋化信号分区；ANGPTL4局部富集提示与血管和/或基质区室相关；ESM1高亮标记厚壁血管结构。NNMT表达呈现红色灶状高表达，与T/NK细胞耗竭区域存在显著空间共定位，表明NNMT可能通过细胞炎症介导T/NK细胞免疫受损。
在肾癌进展中，T/NK细胞呈耗竭状态。研究人员整合空间转录组学与拟时序分析，UMAP聚类鉴定出12个细胞亚群（Cluster 0-11)，涵盖肿瘤核心至基质基质及免疫浸润区域的空间分布。拟时序轨迹分析显示内皮细胞处于分化前期状态，而T/NK细胞和巨噬细胞在肿瘤进展后期表现出更高的分化活性，提示TME内存在空间 resolved 的分化层级和功能转换。
关于ccRCC肿瘤微环境中基于空间分辨的细胞-细胞通讯网络，H&E染色显示肿瘤巢与基质间存在清晰界限。空间NMF将肿瘤核心划分为9个功能亚区（NMF1-NMF9)，NMF特征在肿瘤-基质边界强烈富集，提示内皮细胞和癌症相关成纤维细胞（CAF)间存在空间通讯。COMMOT算法解码的配体-受体相互作用网络显示，CAF、T/NK细胞和巨噬细胞间存在强烈的相互作用；ANGPTL、CXCL和TGF-β三条信号轴呈主导活性。枢纽基因TRAC在ANGPTL轴中-晚期、CXCL和TGF-β轴的早期-中期显著上调，体现时序性激活模式。
NNMT促进ccRCC凋亡相关免疫逃逸。单细胞转录组t-SNE分析鉴定出内皮细胞、CAF和巨噬细胞等主要亚群，NNMT被确认为关键的内皮细胞标志物。功能富集分析显示内皮细胞与凋亡通路显著关联。拟时序推断将内皮细胞置于多谱系分化的前体状态，缺氧特征投影显示内皮细胞亚群存在异质性缺氧响应。研究人员构建的共表达网络鉴定出6个与氧感知、缺氧响应相关的功能模块（MP1-MP8)，其中MP1调控凋亡信号级联，NNMT特异性表达于MP1富集细胞亚群，参与凋亡介导的免疫逃逸机制。
高表达NNMT促进ccRCC进展。Boruta算法特征选择显示NNMT为疾病进展的关键贡献基因。Ridge回归AUC矩阵证实NNMT模型具有较高预测效能（AUC>0.6)。总生存期（OS)分析显示NNMT风险比（HR)=1.1973（P=0.018)，疾病特异性生存期（DSS)分析显示HR=1.3554（P<0.001)。TCGA及验证队列中，NNMT在肿瘤组织表达显著高于正常组织（P<0.001)。NNMT与增殖标志物MKI67联合分析显示，NNMT?/MKI67?组患者预后最差，NNMT?/MKI67?组最佳（P<0.001)。空间转录组将样本分为NNMT高表达组和NNMT低表达组，验证NNMT高表达区域的肿瘤特征。
在ccRCC中识别T细胞分子亚型方面，研究人员整合TCGA-KIRC队列的转录组、预后甲基化标志物及体细胞突变位点，基于单样本基因集富集分析（ssGSEA)将患者分为两个分子亚型CS1和CS2，并经相似性网络融合（SNF)、多核学习（CIMLR)和PINSPlus等多种聚类方法验证。CS1亚型以T细胞凋亡通路富集为特征，CS2亚型则表现为免疫抑制表型主导，WNT信号轴显著激活，且PD-1阻断治疗对两亚型均具潜在疗效。
NNMT相关T细胞浸润诱导ccRCC免疫逃逸。免疫检查点分析显示，NNMT高表达伴随共刺激分子CD80、CD28、ICOSLG上调，而免疫检查点抑制剂（ICI)靶点SLAMF7和CD274（PD-L1)表达下调；炎性细胞因子受体CXCL10、CXCL9和IL1R1显著激活。NNMT高表达与效应T细胞（包括CD8?效应记忆T细胞和CD8? T细胞)浸润水平呈正相关，提示NNMT介导免疫逃逸。
靶向NNMT是ccRCC免疫治疗的有前景的协同策略。PRISM分析显示，BET抑制剂I-BET-762和I-BET-151可通过BRD4乙酰化赖氨酸口袋下调PD-L1并重编程免疫细胞；激酶抑制剂BMS-387032（CDK9i)和Pacritinib（JAK2i)亦被预测可调控NNMT，提示存在表观遗传-代谢-免疫交叉调控网络。AI指导的组合策略有望克服"冷"肿瘤耐药。
NNMT敲低抑制ccRCC进展的功能验证。sh-NNMT转染Caki-1和A-498细胞后，CCK-8、Transwell及克隆形成实验证实NNMT缺失显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力。免疫组织化学显示临床样本中NNMT呈阳性表达，且与肾小球损伤相关。
NNMT耗竭恢复CD8 T细胞功能并抑制肾癌免疫逃逸。免疫荧光共定位显示NNMT与KI67在肿瘤区域显著共表达，sh-NNMT处理后共定位明显减弱。CD3?T细胞浸润在sh-NNMT组显著增强，流式细胞术证实CD8? T细胞比例实质性恢复。
抑制NNMT表达促进ccRCC细胞凋亡和炎症消退。qRT-PCR和ELISA检测显示，NNMT敲低导致TGF-β1、KI67、IL-6和IL-1β表达显著降低，BAX和活化型半胱天冬酶-3水平升高，Bcl-2下调，表明NNMT下调可诱导凋亡并增强CD8? T细胞抗肿瘤活性。
讨论部分总结：ccRCC的免疫抑制和代谢紊乱微环境是免疫监视的重要障碍，导致CD8? T细胞功能耗竭和加速凋亡。NNMT在此病理环路中发挥核心枢纽作用，其高表达通过双重机制促成免疫逃逸：一方面，NNMT催化活性消耗NAM，限制NAD?挽救通路；另一方面，1-MNA产物作为免疫调节分子抑制SIRT1去乙酰化酶活性，增强缺氧诱导因子-1α（HIF-1α)稳定性，放大瓦博格效应（Warburg effect)，促进促血管生成因子释放及TGF-β等免疫抑制性细胞因子产生。TGF-β通过经典Smad2/3/4信号级联下调BAX和半胱天冬酶-3、上调Bcl-2，强力诱导CD8? T细胞凋亡。本研究证实NNMT下调可重新激活CD8? T细胞效应功能，阻断TGF-β通路的免疫抑制作用。此外，慢性炎性微环境中IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的持续暴露，结合内皮细胞功能障碍导致的血管通透性增加和血管内皮生长因子（VEGF)异常分泌，形成"炎症-血管异常-T细胞耗竭"的恶性循环。NNMT作为代谢-免疫交叉调控的核心节点，其靶向抑制为重塑ccRCC免疫代谢微环境、克服免疫治疗耐药提供了新的理论依据和治疗策略。
