通过机器学习整合空间转录组学与单细胞转录组学解析肝细胞癌中凋亡细胞清除作用对预后与免疫治疗的影响

《Translational Oncology》：Integrating spatial and single-cell transcriptomics via machine learning to characterize efferocytosis in hepatocellular carcinoma prognosis and immunotherapy

背景

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的肿瘤内异质性与免疫抑制性微环境显著限制了治疗效果。尽管凋亡细胞清除作用（efferocytosis）对于组织稳态至关重要，但其对HCC肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）空间结构及患者预后的影响尚未得到阐明。

方法

研究人员整合了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）、空间转录组学（spatial transcriptomics，ST）以及大规模bulk转录组数据，构建了凋亡细胞清除相关评分系统（Efferocytosis-Related Scoring System，ERG score）。研究识别了分子亚型，并追踪了驱动高凋亡细胞清除特征的关键细胞亚群。随后通过大规模机器学习筛选（101种算法组合）建立稳健的预后模型，并通过体外实验〔实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）/蛋白质印迹（Western Blot）〕进行验证。

结果

ERG评分提示了一种由High_ERGs_SPP1_Mac亚群驱动的特异性免疫抑制状态。在空间层面，该亚群与恶性细胞发生物理共定位，这一过程可能由MDK-SDC2轴介导。基于机器学习构建的风险评分可作为High_ERGs_SPP1_Mac丰度的可靠定量指标，能够有效预测“冷肿瘤”表型以及免疫检查点上调〔如程序性死亡受体1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）〕。此外，实验验证证实核心基因TPI1（三磷酸异构酶1，triosephosphate isomerase 1）上调，这与高风险亚型的高糖酵解特征一致。

结论

ERG评分系统为解析HCC异质性提供了新的视角。研究结果提示，SPP1⁺巨噬细胞可在空间上重塑TME，从而为优化预后分层和个体化免疫治疗提供理论依据。

该文发表于《Translational Oncology》，聚焦肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中凋亡细胞清除作用（efferocytosis）与肿瘤异质性、免疫抑制和临床预后的关系。研究背景在于，HCC具有显著的肿瘤内异质性和复杂的免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），这使得免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）虽已推动晚期HCC系统治疗进展，但仅有部分患者能够获得持久获益。传统分期体系难以充分反映TME的动态特征，因此亟需新的分子标志物来支持预后评估与治疗分层。凋亡细胞清除作用本是由巨噬细胞等吞噬细胞介导的稳态维持过程，在肿瘤环境中却可能被肿瘤利用，诱导肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）向促肿瘤、免疫抑制和代谢重编程方向转化。然而，HCC中凋亡细胞清除相关基因（efferocytosis-related genes，ERGs）的表达图谱、空间分布及其临床意义此前缺乏系统研究，因此开展本研究具有明确必要性。

研究人员围绕ERGs建立了多层次分析框架。首先，通过文献整理获得167个ERGs，并在TCGA-LIHC队列中筛选出与总生存（overall survival，OS）相关的预后基因，进一步结合GSE14520等外部队列，利用一致性聚类识别出两类具有不同凋亡细胞清除活性的HCC分子亚型。结果显示，Cluster 2具有更高的ERG评分和更差的生存结局，且在分子特征上表现为上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、糖酵解、炎症信号激活，而成熟肝细胞相关代谢通路被抑制。这说明高ERG状态对应更强的恶性生物学行为和代谢重塑特征。进一步的基因组分析显示，两亚型在TP53、CTNNB1等驱动基因突变频率及拷贝数变异（copy number variation，CNV）模式上存在差异，提示其背后具有不同的遗传基础。

在免疫微环境层面，研究发现高ERG亚型并非简单“免疫缺失”，而是一种具有高免疫分数但功能抑制显著的状态。Cluster 2中M0巨噬细胞和调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）富集，同时CD47、CTLA4、PDCD1等免疫检查点分子表达升高，肿瘤免疫功能障碍与排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion，TIDE）评分亦更高，提示该亚型更易发生免疫逃逸，更接近“冷肿瘤”表型。相较之下，Cluster 1富集活化自然杀伤细胞（NK细胞）和单核细胞，可能更有利于免疫治疗应答。

为在细胞分辨率上明确ERG信号来源，研究人员整合3个GEO单细胞RNA测序队列，对133239个高质量细胞进行分析，构建了HCC单细胞图谱，识别出T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、浆细胞和上皮细胞9大类细胞群。ERG评分在髓系细胞中最为富集，提示凋亡细胞清除特征主要由该谱系承担。随后对髓系细胞进一步亚群分析，识别出SPP1⁺巨噬细胞、TREM2⁺巨噬细胞、CXCL10⁺巨噬细胞、CCL3⁺巨噬细胞、MARCO⁺巨噬细胞、单核来源DC样细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）和单核细胞。其中，SPP1_Mac和TREM2_Mac主要富集于肿瘤组织，而单核细胞更多存在于正常组织。拟时序分析表明，肿瘤来源髓系细胞沿分化轨迹持续表现出更高ERG表达，而这一特征主要由SPP1⁺巨噬细胞驱动，TREM2⁺巨噬细胞亦有部分贡献。进一步将SPP1_Mac分为High_ERGs_SPP1_Mac和Low_ERGs_SPP1_Mac后发现，高ERG亚群富集缺氧、血管生成、EMT和IL6-JAK-STAT3信号，呈现更典型的促肿瘤功能状态；低ERG亚群则更偏向干扰素反应和胆汁酸代谢等通路。

该研究的重要创新之一在于整合单细胞转录组学与空间转录组学，解析高ERG巨噬细胞的原位空间行为。通过对HCC空间转录组样本VISDS000512和VISDS000516进行反卷积与邻域分析，研究人员发现High_ERGs_SPP1_Mac与恶性细胞之间形成更紧密的异质性邻域网络，并出现显著共定位。MISTy空间依赖分析进一步支持二者具有更强的空间交互潜能。CellChat分析显示，High_ERGs_SPP1_Mac是TME中的核心通讯枢纽，与恶性细胞之间的信号交流最为强烈。对配体-受体轴的进一步筛查提示，MDK-SDC2可能是介导该相互作用的重要分子机制；空间特征图证实MDK与SDC2在肿瘤区域具有重叠表达，而MDK在High_ERGs_SPP1_Mac中的表达显著高于Low_ERGs_SPP1_Mac。这些结果共同说明，高ERG的SPP1⁺巨噬细胞不仅在转录特征上具有促肿瘤倾向，而且在组织空间上与恶性细胞构成了功能耦联的生态位。

在临床转化层面，研究人员从High_ERGs_SPP1_Mac特征基因中筛得148个候选基因，并采用10类经典机器学习算法构建101种组合模型，在TCGA-LIHC训练集及GSE14520、GSE116174外部验证集中系统比较预测性能，最终确定Lasso + GBM为最优模型。该模型纳入10个核心特征基因：SPP1、FABP5、TPI1、LDHA、TREM1、S100A9、IL1RN、SLC2A1、ANGPTL4和MIF。风险评分在三个队列中均能有效区分高低风险患者，且具有较好的时间依赖受试者工作特征曲线（ROC）表现。同时，该风险评分是独立预后因子，并与T分期、病理分期共同构建了列线图（nomogram）。更重要的是，风险评分与ERG评分及High_ERGs_SPP1_Mac浸润密度呈正相关，高风险组表现出更高的PDCD1、CTLA4、CD47、LGALS9表达、更低的细胞毒性淋巴细胞和NK细胞浸润，以及更高的TIDE和免疫排斥评分，说明该模型本质上反映了High_ERGs_SPP1_Mac驱动的免疫抑制性“冷肿瘤”生态。

方法概括：研究主要使用TCGA-LIHC、GSE14520、GSE116174 bulk转录组队列，3个GEO单细胞RNA测序队列（GSE149614、GSE151530、GSE156625）以及2个HCC空间转录组样本（VISDS000512、VISDS000516）。采用一致性聚类、ESTIMATE、ssGSEA、CIBERSORT、TIDE、inferCNV、Monocle2、CytoTRACE、CellChat、RCTD、MISTy、GSEA等方法解析分子分型、细胞异质性、空间互作和免疫状态；并基于10类机器学习算法构建101种预后模型，最后以qRT-PCR和Western Blot对TPI1进行体外验证。

以下结合论文结果小标题进行概括。

Identification of efferocytosis-related prognostic genes in HCC
研究人员从文献中整理167个ERGs，经单因素Cox回归筛选出37个与OS相关的预后基因。这些基因普遍存在CNV异常，部分基因如FCER1G、S100A9、NCF2、FABP4、FABP5表现为扩增；同时，PER1、CYP27A1、ODC1等基因存在体细胞突变。TCGA队列中多数预后ERGs在肿瘤与正常组织间存在显著差异表达，说明ERGs在HCC中具有广泛的分子异常基础。

Consensus clustering identifies two molecular subtypes in HCC
基于29个在TCGA-LIHC与GSE14520中共有的ERGs，研究识别出两种HCC分子亚型。Cluster 2具有更高ERG评分和更差生存结局，是独立不良预后因素。该亚型伴随SPP1、MMP9、MMP14、S100P等关键基因上调，并富集EMT、糖酵解和炎症通路，而胆汁酸代谢、脂肪酸代谢、PPAR信号等肝细胞成熟相关功能下降。

Somatic variation analysis and immune infiltration landscape of the two subtypes
两亚型在基因组变异和免疫浸润方面存在明显差异。Cluster 2中TP53突变更常见，且伴有8q24.21和1q21.3高频扩增；免疫上则表现为M0巨噬细胞和Tregs富集、免疫检查点高表达及更高TIDE评分，提示该亚型处于免疫抑制和免疫逃逸状态。

Single-cell atlas landscape of HCC
单细胞图谱显示，HCC组织中髓系细胞和T细胞比例上升，内皮细胞比例下降；髓系细胞是肿瘤组织中的主要通讯中心。inferCNV与CytoTRACE分析进一步证明恶性上皮细胞具有更高干性和更低分化程度。ERG评分主要集中于髓系细胞，为后续锁定关键亚群提供依据。

Elevated efferocytic activity characterizes the SPP1⁺ macrophage subset
髓系细胞再分群后，SPP1⁺巨噬细胞成为高ERG特征最突出的亚群。拟时序分析显示，肿瘤来源髓系细胞随着分化进程ERG评分逐渐升高，而SPP1⁺巨噬细胞升高最显著。进一步比较发现，High_ERGs_SPP1_Mac富集缺氧、血管生成、EMT和IL6-JAK-STAT3信号，提示其具有更强的促肿瘤与免疫抑制潜能。

Integrated spatial and single-cell analysis reveals close interaction between High_ERGs_SPP1_Mac and malignant cells
研究通过CellChat、RCTD、邻域分析和MISTy证明，High_ERGs_SPP1_Mac在空间上与恶性细胞紧密邻接并具有更强互作。与Low_ERGs_SPP1_Mac相比，高ERG亚群与恶性细胞之间的MDK信号更活跃，尤其MDK-SDC2配体-受体对具有较高互作概率，提示该轴可能参与维持其特异性空间生态位和旁分泌支持作用。

Construction of a prognostic model based on High_ERGs_SPP1_Mac related genes
利用High_ERGs_SPP1_Mac特征基因构建的Lasso-GBM模型在训练集和验证集中均展现稳定预后预测能力。风险评分不仅可有效进行生存分层，还与ERG评分和High_ERGs_SPP1_Mac浸润程度正相关；高风险组同时表现出免疫检查点激活、细胞毒性免疫细胞耗竭和“冷肿瘤”特征，因此该模型具有明确的生物学指向性。

Screening and validation of the key core gene TPI1 from prognostic models
在101个模型中，TPI1、SPP1、S100A9和LDHA为高频入选基因，其中TPI1的危险比最高。TCGA-LIHC与GSE14520均证实TPI1在HCC组织中高表达，且高表达与较差OS相关。体外实验进一步表明，Huh7和SMMC-7721细胞中TPI1的mRNA和蛋白表达均高于正常肝细胞MIHA，支持其作为核心代谢性风险基因的地位。

讨论部分总结
论文讨论指出，ERG评分系统不仅是统计学上的预后工具，更可作为反映HCC免疫抑制状态的功能性指标。高ERG评分定义了一个具有糖酵解增强、缺氧适应、免疫检查点升高和效应免疫细胞排斥的恶性亚型。研究将该表型进一步锚定到High_ERGs_SPP1_Mac这一特定细胞亚群，说明其可能是高凋亡细胞清除活性的主要执行者和促肿瘤驱动者。空间转录组证据又进一步说明，这类巨噬细胞并非孤立存在，而是与恶性细胞形成紧密的空间共生关系，MDK-SDC2轴可能是其中的重要通讯机制。机器学习风险模型则将这种复杂生物学信息转化为可量化、可泛化的临床工具，并借助TPI1的实验验证增强了模型的可解释性。作者同时指出，本研究主要基于回顾性公共队列，缺乏直接功能实验验证High_ERGs_SPP1_Mac的吞噬能力，MDK-SDC2轴也尚待进一步实验证实。

研究结论翻译
ERG评分系统为解析HCC异质性提供了新的视角。研究结果提示，SPP1⁺巨噬细胞可在空间上重塑肿瘤微环境，为优化预后分层和个体化免疫治疗提供理论基础。