《Scientific Reports》：Simultaneous spectrofluorimetric determination of nasal cyclic nucleotides as biochemical markers in post-COVID-19 olfactory dysfunction using supramolecular-enhanced derivative spectroscopy
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嗅觉功能障碍与两种参与嗅觉信号转导的关键第二信使水平变化有关：环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）和环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）。研究人员采用基于环糊精的荧
嗅觉功能障碍与两种参与嗅觉信号转导的关键第二信使水平变化有关：环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）和环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）。研究人员采用基于环糊精的荧光光谱技术结合一阶导数同步荧光光谱法，同时测定鼻分泌物中的cAMP和cGMP。利用羟丙基-β-环糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HP-β-CD）增强荧光，从而减少光谱重叠并增强信号强度。在波长差（Δλ）为50 nm条件下进行同步荧光扫描，随后进行一阶导数处理，可在420 nm处选择性测定cAMP、在455 nm处选择性测定cGMP。该方法在1–100 ng/mL浓度范围内呈线性响应，相关系数良好。cAMP和cGMP的检测限（limit of detection, LOD）分别为0.210 ng/mL和0.252 ng/mL，定量限（limit of quantification, LOQ）分别为0.630 ng/mL和0.756 ng/mL。该开发平台的临床应用显示，COVID-19后嗅觉丧失患者鼻环核苷酸水平显著降低。患者组cAMP和cGMP浓度（分别为19.37 ± 3.18和9.24 ± 1.20 ng/mL）较健康个体（分别为73.25 ± 6.20和39.64 ± 3.18 ng/mL）明显降低。受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析的统计验证显示，cAMP和cGMP的曲线下面积（area under the curve, AUC）分别为0.99和0.98，表明所开发方法适用于复杂生物基质中这些生物标志物的灵敏分析，有助于理解嗅觉功能障碍相关的生化变化。
嗅觉功能障碍是COVID-19后常见的持续性临床症状，其分子机制尚未完全阐明。环磷腺苷（cAMP）和环鸟鸟苷酸（cGMP）作为嗅觉信号转导通路中的核心第二信使，在将气味分子的化学信号转化为电信号过程中发挥关键作用。当气味分子与G蛋白偶联受体结合后，腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶分别催化三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸鸟苷（GTP）生成cAMP和cGMP，进而调控环核苷酸门控离子通道的开放，介导钙离子和钠离子内流，最终产生嗅感觉神经元的动作电位。既往研究表明，嗅觉损伤与cAMP及cGMP水平紊乱密切相关。然而，现有检测技术存在明显局限：酶联免疫吸附测定（ELISA）虽具高通量优势，但在复杂生物基质中易受基质效应和交叉反应干扰；液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）虽为金标准，但仪器成本高昂、分析周期长且需专业技术人员操作，难以从研究实验室向常规临床诊疗转化。因此，开发一种成本效益高、操作简便且灵敏度可靠的检测方法，对于COVID-19后嗅觉功能障碍的临床监测和机制研究具有重要意义。该研究发表于《Scientific Reports》。
研究人员开展的创新性工作基于以下核心技术方法：采用羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）作为超分子主体，通过主客体包合作用增强cAMP和cGMP的荧光特性；结合同步荧光扫描技术（固定波长差Δλ=50 nm）实现光谱分离；运用一阶导数数学处理进一步消除残余光谱重叠，建立"一锅法"定量分析平台。临床样本来源于埃及Al-Azhar大学Damietta医学院耳鼻喉科招募的20例受试者，包括9例嗅觉功能正常的健康对照（平均年龄44岁）和11例COVID-19后持续完全性嗅觉丧失患者（平均年龄45岁，RT-PCR确诊，感染后嗅觉丧失持续至少6个月），所有参与者均经Sniffin' Sticks测试验证嗅觉功能状态。
研究结果部分涵盖以下方面：
荧光光谱特性研究 研究人员系统考察了cAMP和cGMP的荧光行为特征。两种环核苷酸因其嘌呤结构而具有本征荧光，但在水溶液中荧光信号微弱且易受猝灭影响，同时存在显著的光谱重叠。HP-β-CD包合后，其疏水空腔与cAMP和cGMP的嘌呤部分形成包合物，有效刚性化分子结构、屏蔽非辐射碰撞和水相猝灭，使cAMP和cGMP的最大荧光发射分别红移至402 nm和448 nm。通过同步荧光扫描（Δλ=50 nm）和一阶导数处理，最终在420 nm和455 nm处实现两者的选择性定量，零交叉点消除相互干扰。
测量条件优化 研究人员对关键实验参数进行了系统优化。波长差（Δλ）筛程20–80 nm，确定50 nm为最佳条件，兼顾灵敏度与光谱分辨率；考察蒸馏水、甲醇、乙腈和三氯甲烷四种稀释溶剂，证实蒸馏水因高极性和氢键形成能力最能稳定cAMP和cGMP电子态，为最优选择；评估不同pH和缓冲体系，确定磷酸盐缓冲液（pH 7.5）最接近生理条件，可有效维持分析物结构稳定性和荧光特性。
方法学验证 所建立方法经国际人用药品注册技术协调会（ICH）指南验证，在1–100 ng/mL范围内呈良好线性（r
2≥0.9996），cAMP和cGMP的LOD分别为0.210 ng/mL和0.252 ng/mL，LOQ分别为0.630 ng/mL和0.756 ng/mL。准确度和精密度考察显示，三个浓度水平（10、30、60 ng/mL）的日内和日间相对标准偏差（relative standard deviation, RSD%）均低于1.0%，平均回收率分别为99.87%（cAMP）和99.44%（cGMP）。耐用性试验中，缓冲液pH（±0.5单位）、缓冲液体积（±0.25 mL）和HP-β-CD体积（±0.1 mL）的微小变动均未对结果产生显著影响。选择性验证采用白蛋白、乳铁蛋白、黏蛋白、L-谷氨酸和氯化钠等潜在内源性干扰物，回收率均维持在接近100%水平。
临床应用 该方法应用于COVID-19后嗅觉功能障碍的临床诊断评估。两组受试者在年龄和体质指数（body mass index, BMI）等基线参数上无显著差异。患者组cAMP浓度从健康对照的73.25±6.20 ng/mL降至19.37±3.18 ng/mL，cGMP从39.64±3.18 ng/mL降至9.24±1.20 ng/mL，双因素方差分析（Two-way ANOVA）显示临床状态对环核苷酸水平有极显著影响（F(1,36)=26.59，p<0.0001）。Spearman秩相关分析揭示鼻cAMP和cGMP浓度与TDI总分呈极强正相关（r=0.996和0.992，p<0.0001）。ROC曲线分析显示cAMP和cGMP的AUC分别为0.99和0.98，最佳临界值分别为43.22 ng/mL和24.24 ng/mL，灵敏度均达100%。
讨论部分，研究人员指出该超分子-导数光谱联用策略的核心优势在于：HP-β-CD包合不仅增强荧光信号，还通过分子刚性化和微环境调控改善光谱分辨率；同步扫描与导数处理的结合避免了繁琐的色谱分离步骤，实现真正意义上的一步式分析。临床发现的鼻环核苷酸耗竭提示，COVID-19后嗅觉功能障碍可能存在嗅神经上皮直接损伤或腺苷酸环化酶功能下降等病理机制，cGMP降低可能进一步影响中枢适应和恢复过程，但这些机制假说尚需更多实验验证。研究局限性包括样本量较小（初步概念验证）、横断面设计缺乏动态追踪，以及未涵盖其他潜在内源性干扰物的全面评估。未来需开展大规模多中心纵向队列研究以确立其临床诊断价值。
研究结论表明，研究人员成功开发了一种基于环糊精的荧光光谱结合一阶导数同步扫描的方法，用于同时测定cAMP和cGMP。该方法具有宽线性范围（1–100 ng/mL）、优异灵敏度（LOD：0.210和0.252 ng/mL）及高回收率（99.44–99.87%）。与传统ELISA或LC–MS/MS方法相比，该策略无需耗时衍生化或昂贵仪器，在保持相当精度的同时提供了成本效益更高的解决方案。临床应用发现COVID-19后嗅觉功能障碍患者鼻cAMP和cGMP水平显著降低，提示鼻环核苷酸缺乏可能作为病毒感染后嗅觉功能障碍的相关生化标志物。尽管尚需更大规模验证，该方法为临床研究和筛查调查提供了值得关注的技术平台。
