《Current Opinion in Structural Biology》：Advancements in single-molecule fluorescence spectroscopy for probing conformations, dynamics, and interactions in disordered protein regions
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单分子荧光光谱涵盖了一系列用于探测固有无序区域（IDRs）动态构象系综的技术。通过解析亚群体特异性性质并跨越从纳秒到秒的时间尺度，这些测量提供了群体测量通常无法获得的观测值。研究人员在此将关键挑战与最新进展置于背景中加以讨论，包括整合实验、模拟和理论以量化序列
单分子荧光光谱涵盖了一系列用于探测固有无序区域（IDRs）动态构象系综的技术。通过解析亚群体特异性性质并跨越从纳秒到秒的时间尺度，这些测量提供了群体测量通常无法获得的观测值。研究人员在此将关键挑战与最新进展置于背景中加以讨论，包括整合实验、模拟和理论以量化序列编码效应，以及利用光子统计分析来表征蛋白质动力学。研究人员还总结了单分子荧光方法的扩展应用，以解码生物分子凝聚体中IDR的构象、动力学和空间组织。这些技术进步共同使得单分子荧光光谱在研究IDR功能方面日益普及，而IDR生物学和物理学的复杂性持续推动着进一步的方法学创新。
**引言**
单分子F?rster共振能量转移（smFRET）和荧光相关光谱（FCS）对于推进研究人员对生物分子结构动力学的理解至关重要。研究人员在此综述了单分子荧光光谱在研究固有无序区域（IDRs）方面的近期应用和方法学进展，该区域缺乏稳定的三维结构，却在细胞功能中发挥关键作用。这些技术揭示了序列性质如何影响从配体结合到纳入生物分子凝聚体等过程中的构象、动力学和分子间相互作用，跨越了广泛的长度尺度和时间尺度。这些技术的应用为描述IDR性质的聚合物物理模型和计算方法提供了信息。尽管标准化程度和常规应用日益提高，近期工作表明，在方法学开发方面仍存在大量机会，以揭示IDR行为的新方面。
**单分子FRET与模拟整合探测IDR构象及相互作用**
smFRET已成为表征蛋白质构象的重要方法，通过近期多实验室盲测研究证明了其高度精确的供体-受体间距离测量能力。在IDR背景下，smFRET测量与模拟的整合为模拟结果提供了一致性检验，并实现了FRET距离对信息的插值。全原子及粗粒化力场的改进缩小了实验与计算之间的差距。例如，利用多个FRET标记位点，研究人员已在转录因子Sox2、翻译因子eIF4B、α-突触核蛋白以及连接组蛋白H1与前胸腺素α及核小体的结合等体系中报道了模拟与实验之间优异的构象一致性。实验与模拟之间、以及实验与机器学习预测器之间差距的缩小，可能暗示可单独依赖计算工具描述IDR构象。然而，由于IDR序列-构象空间相较于结构化蛋白质而言在实验上远未充分探索，计算模型的可靠性仅取决于用于基准测试的序列。确实，近期探测序列性质和溶液条件的实验突出了序列空间扩展时的挑战。在迄今最全面的检验序列如何编码IDR构象行为的实验研究中，Holla等分析了16个等长度的IDR，对应于天然存在的折叠RNA结合结构域之间的连接区域。这些IDR连接子在疏水性、净电荷、电荷分离程度以及特定氨基酸富集方面存在差异。smFRET揭示了转移效率的巨大差异，其链尺寸无法由任何单一序列特征解释，凸显了序列-系综关系的复杂性。
多种计算和理论模型被评估并与该smFRET数据集进行基准测试。常用于描述IDR的全原子力场，如ABSINTH和AMBER ff99sbws，捕获了大多数实验观测，但显示出 distinct 局限性：ABSINTH对富含甘氨酸和天冬酰胺的序列显示出较大偏差，而AMBER在重新加权盐桥数量后有所改善。此外，由深度学习模型STARLING（基于粗粒化模拟训练）生成的末端距分布与全原子模拟具有可比性的一致性。有趣的是，在粗粒化和全原子模拟中显式包含染料适度改善了吻合度。这些结果有助于将染料效应置于序列尺寸的背景中——这是对任何基于染料测量的常见批评——并强调了显式染料纳入以解释光物理效应和构象偏好的重要性。最后，相同的16个序列（连同不同序列长度的高度负电荷IDR）作为聚合物理论的基准，帮助推导了包含反离子凝聚效应的新预测模型。有人可能基于模拟的成功而认为解析模型已被超越，但此类模型对于揭示和概括支配IDR构象和相互作用的原则仍然至关重要。除反离子凝聚外，电荷图案化和拥挤效应等因素也影响IDR构象和结合。虽然模拟可以可靠地捕获这些贡献，生成模型可以扩展模式以进行预测推断，但解析模型为解释跨多样序列的潜在机制提供了统一框架。
smFRET相对于核磁共振（NMR）和小角X射线散射（SAXS）等互补群体方法提供了独特信息，因其能产生长程、位置依赖的信息。此外，揭示由构象偏置和/或与邻近结构域的瞬态相互作用或配体结合产生的亚群体的能力，是单分子检测的关键优势，也是改进计算建模的下一个挑战之一。在这方面，近期smFRET研究利用IDR构象变化监测IDR与其他IDR、折叠蛋白结构域以及核酸的结合平衡，考察了静电作用、磷酸化和手性的作用。总体而言，这些结果突出了smFRET的多功能性，同时强调需要探索更广泛的序列-构象和溶液条件空间以全面捕获IDR物理学。
**研究IDR动力学的技术及分析改进**
动力学测量对于理解IDR功能机制至关重要。IDR通过多种模式相互作用，从结合时折叠到形成高度动态复合物，其中构象灵活性促进了对特定相互作用基序的识别。单分子荧光提供了跨多时间尺度研究蛋白质动力学的强大工具集，这对IDR尤为重要，其链内动力学常发生在纳秒时间尺度，但可被分子间相互作用减慢。检测荧光光谱中动力学的常见方法是信号相关。纳秒FCS（nsFCS）利用光子诱导电子转移（PET-nsFCS）和FRET（FRET-nsFCS）测量IDR动力学。PET-nsFCS依赖于荧光涨落，该涨落与荧光团与猝灭剂（常为蛋白质中的芳香族残基或另一荧光团）之间暗态、静态复合物的形成相关。FRET-nsFCS通过反相关的供体-受体发射概率探测供体-受体间距离涨落。然而，两种方法均需大量数据采集以获得足够的统计信息。例如，FRET-nsFCS单次测量可能需约10小时，且极快动力学的检测可能被荧光团寿命的反聚束效应掩盖。零模波导（ZMWs）增加光子预算、缩短有效寿命并有效增加F?rster半径，将采集时间缩短数个数量级，同时将可及时间尺度扩展至数纳秒，并允许更好地区分更大距离。然而，这些优势为定量数据解释引入了新挑战，需要仔细校准寿命和F?rster半径。ZMWs近期被用于测量前述16个IDR序列中部分序列的链内动力学，观察到链尺寸（及序列延伸）与相应重配置时间之间缺乏相关性。重要的是，这些重配置时间与模拟吻合良好，凸显了在建模中不仅模拟构象系综，还模拟其动力学的进展。由于IDR功能由其构象系综及系综被采样的相关时间尺度共同决定，这标志着另一重要技术进步。理解序列组成如何影响动力学仍是开放挑战，特别是关于内摩擦与链尺寸之间的耦合。
除nsFCS外，共聚焦smFRET利用寿命信息和光子统计补充性地获取微秒及更慢动力学。单脉冲寿命与转移效率的比较可报告构象及态间动力学。在荧光寿命相关光谱中，寿命衰减函数被关联；在过滤FCS（fFCS）中，寿命衰减函数用于过滤FRET相关函数。动态光子分布分析（PDA）能够模拟FRET效率分布，从而将散粒噪声与底层构象异质性和动态交换分离开。其他光子流方法，如脉冲方差分析（BVA），通过将脉冲分割为固定光子段来表征动力学，然后比较这些段内转移效率的方差与散粒噪声方差，以判断转移效率直方图中的过量宽度是否反映底层动力学。在更新的时间分辨形式中，段大小在脉冲持续时间内系统变化，从FRET方差衰减中推导微秒至毫秒时间尺度的动力学速率。该方法的框架基础上，Terterov等引入了FRET效率相关光谱（FECS），一种无模型方法，用于测量从纳秒到毫秒的动力学。在FECS中，FRET相关通过按光子对类型（供体-供体、受体-受体、受体-供体、供体-受体）分类光子对并构建光子对检测滞后时间的直方图而产生，无视光子来源的脉冲。用所有光子对获得的直方图归一化这些直方图，提供了一种去除传统FCS中测量到的扩散分量的相关，极大地简化了可能否则与扩散重叠的慢时间尺度多态转换动力学的读出，同时提供了光物理效应（如光漂白）的诊断。
其他光子流分析包括逐光子隐马尔可夫模型和最大似然估计（MLE），这些方法已在表面固定系统中得到广泛测试。这些方法允许定量快于逆光子间时间、慢于每脉冲一次转换的速率。近期在自由扩散分子方面取得的进展已将此类方法应用于IDR背景中，以解析Aβ42寡聚化。最有趣的MLE应用之一是过渡路径时间的量化——成功穿越两个构象状态之间能垒的特征持续时间，通常发生在微秒时间尺度。过渡路径在表征与配体的相互作用时在IDR背景下变得相关。虽然这些测量因有限光子预算而具有挑战性，但利用DNA折纸纳米天线的等离激元增强已被证明可提升光子计数率。
**单分子荧光在生物分子凝聚体中的应用及挑战**
过去十五年来，生物分子凝聚体——被认为通过相分离或细胞组分渗流形成的致密细胞组装体——引起了相当大的关注。虽然IDR已成为这些组装体的关键元素，但将分子IDR行为与介观凝聚体性质联系起来在实验上仍具挑战性。对于单分子荧光方法，凝聚体测量的主要挑战来自：高荧光背景，源于高浓度未标记分子和累积杂质；荧光分子扩散缓慢（如果有的话），导致更长的脉冲，增加了光漂白概率；以及致密相内的异质性，使数据解释复杂化。尽管如此，过去10年仍取得了持续的技术进步。例如，FCS已被用于测量稀相和致密相中的分子分配和扩散，并评估盐效应及凝聚体内的老化/聚集动力学。这些测量需要仔细校准以提取绝对浓度，需考虑折射率变化、共聚焦体积畸变和背景信号等挑战；使用扫描FCS时可缓解这些挑战。与细胞内单分子检测类似，使用波长长于530 nm的染料可减少凝聚体分子的背景自发荧光。FRET-nsFCS也被用于量化多阳离子序列形成的凝聚体中前胸腺素α的构象动力学。通过捕获纳米尺度构象涨落（通过FRET）和微尺度平移扩散（通过FCS），这些测量建立了凝聚体内分子和介观输运性质之间的机制联系。最后，单分子荧光定位和粒子追踪技术的进步使得评估凝聚体内的扩散和异质性成为可能。例如，点积累纳米形貌成像（PAINT）已被用于测量凝聚体内肉瘤融合蛋白（FUS）纳米域的扩散动力学和空间取向。此外，单分子取向-定位显微镜从偏振偶极发射推断分子取向，解析了hnRNPA1和DDX4生物分子凝聚体内的纳米和微米尺度异质性。
**研究IDR的新方法**
近期技术进步有望通过扩展检测范围和灵敏度，使IDR的单分子荧光测量更加普及。开源硬件平台提供经济高效的仪器化，而自动化可提高测量通量。在日益增长的超分辨显微镜类别中，MINFLUX（最小荧光光子通量显微镜）已被证明可以以埃分辨率定量距离分布，低于和高于标准FRET实验的典型检测极限，同时仅需最少光子数。FRET-荧光寿命成像的新应用可进一步帮助以20-30 nm分辨率解析分子间相互作用。反布朗电捕获（ABEL）陷阱的使用将自由扩散分子的观测时间从毫秒延长至秒，允许紧密间距FRET群体的反卷积，以及同时从陷阱内分子布朗运动测量流体力学半径。虽然这些实验方法尚未直接应用于IDR，但它们在核酸聚合物系统中的可行性已得到证明，表明其对未来研究将日益有价值。
尽管在理解IDR的生物物理和生物化学方面已取得进展，许多未解决的方面仍有待解决，如解析双稳态结构系综以及IDR的微相和胶束状态中的构象和动力学，无论是体外还是在细胞中。虽然细胞内IDR测量仍具挑战性，需要使用大荧光蛋白或合成标记蛋白质的显微注射，但近期进展展示了原位特异性合成染料标记用于表征IDR的可行性。随着当前和 forthcoming 技术进步，单分子荧光方法继续非常适合应对IDR生物学的复杂性，跨越大的空间和时间范围，解决构象系综和动力学如何告知功能的问题。
