《Veterinary Research Communications》：Blood swabs represent an alternative sample matrix for detection of antibodies against classical swine fever virus during surveillance in wild boar
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对死亡野猪开展被动监测（passive surveillance）是发现法定报告疫病的重要工具，尤其适用于检测临床病理表现相近的猪瘟（CSF）与非洲猪瘟（ASF）。在鉴别诊断过程中，采用同一种样本基质检测两种疾病具有明显优势。特别是在无法从野生猪属动物采集到血
对死亡野猪开展被动监测（passive surveillance）是发现法定报告疫病的重要工具，尤其适用于检测临床病理表现相近的猪瘟（CSF）与非洲猪瘟（ASF）。在鉴别诊断过程中，采用同一种样本基质检测两种疾病具有明显优势。特别是在无法从野生猪属动物采集到血清样本时，血液拭子已被证明是ASF诊断中的一种替代样本基质。基于此，研究人员拟采用猪瘟抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验（virus neutralization test, VNT）对血液拭子进行血清学分析。研究共检测29份猪瘟抗体阳性样本和100份猪瘟抗体阴性样本。结果表明，该样本基质同样适用于检测猪瘟病毒（CSFV）抗体。总体而言，与血清检测相比，血液拭子的敏感性略有降低，这可能影响感染后早期血清学转换阶段样本的判定。然而，在CSFV感染后≥21 d采集的样本均可被可靠地检出为抗体阳性。
该文发表于《Veterinary Research Communications》，聚焦于野猪猪瘟（Classical swine fever, CSF）与非洲猪瘟（African swine fever, ASF）监测中的实际采样难题。研究背景在于，CSF是一种累及家猪和野生猪属动物的严重全身性传染病，其临床表现和病理变化常与ASF相近，因此在野猪监测中必须进行鉴别诊断。欧盟近年来虽未再报告CSF流行，但随着全球贸易和动物相关流动持续增加，CSF再次传入无疫区的风险始终存在。对死亡野猪开展被动监测，是尽早发现疫病传入的重要防线。然而在现场采样中，研究和防控人员常常难以从死亡野猪尸体中获得质量良好且数量充足的血液或血清，这限制了传统血清学检测的实施。既往研究已提示，干燥血液拭子在ASF病原学检测以及ASF抗体检测中具有实用价值，同时也可用于CSFV基因组检测，但其是否适用于CSF抗体检测尚缺乏证据。因此，本研究以概念验证（proof-of-concept）的方式，评估血液拭子作为CSFV抗体检测替代样本基质的可行性，并分析其在ELISA与病毒中和试验中的适用性和局限性。
研究人员收集了CSFV抗体阳性的血清和EDTA抗凝血样本，这些样本来源于不同基因型CSFV实验感染猪的样本库，共分析29份阳性样本，并纳入4头家猪感染后不同时间点的连续样本。此外，还检测了50份家猪和50份野猪CSFV抗体阴性样本。由于当前欧盟缺乏自然感染野猪现场样本，研究人员进一步采用来自野猪、疣猪和红河猪的阴性血样，与183 d感染后获得的高滴度阳性血清按1:4、1:8、1:16和1:32比例混合，模拟不同抗体水平条件。样本制备方面，采用GenoTube Livestock拭子吸附全血或血清，经室温过夜干燥后洗脱，用于两种商业化CSF抗体ELISA及CSFV特异性VNT检测，并以对应血清和血清拭子作为对照。
技术方法方面，研究主要采用三类关键技术。其一，构建血清、血清拭子和血液拭子三种样本基质的平行比较体系，以评估拭子处理和血液基质本身对检测信号的影响。其二，采用两种商业化猪瘟抗体ELISA，即IDEXX CSFV Ab和ID Screen
? Classical Swine Fever E2 Competition，对不同时间点和不同样本类型进行重复检测。其三，依据欧盟猪瘟参考实验室诊断手册，使用CSFV参考毒株Diepholz（基因型2.3）和Alfort/187（基因型1.1），在PK 15细胞上开展病毒中和试验，以确认可疑或阳性样本并比较中和抗体滴度。样本来源主要为德国相关参考实验室保存的实验感染猪样本，以及实验条件下获得的野生猪属动物阴性血样。
Serum represents the preferred sample matrix for detection of antibodies against CSFV.
这一部分首先明确了血清仍然是检测CSFV抗体的首选样本基质。研究人员将感染后采集的猪血样制成血液拭子，并首先使用IDEXX CSFV Ab ELISA进行检测，同时纳入对应血清样本和血清拭子作为对照。结果显示，与原始血清相比，血清拭子的阻断率平均下降约5%，提示拭子洗脱过程本身存在一定稀释或信号衰减效应；而血液拭子的阻断率较对应血清进一步显著降低，平均约下降9%，说明血液基质本身也会对检测敏感性产生影响。尽管如此，所有在感染后≥21 d采集的血液拭子，以及1份17 d采集的样本，均仍被判定为CSFV抗体阳性。该结果说明，在抗体水平较高的阶段，血液拭子具备可靠检出能力。
然而，研究人员进一步指出，这种敏感性下降在感染早期可能影响样本分类。为此，研究纳入4头感染猪在0、7、14、21及27或28 d post infection（dpi）采集的连续样本，系统分析血清学转换过程中的检测表现。
Detection of antibodies against CSFV using two commercial CSF antibody ELISAs.
这一部分通过两种商业化ELISA比较不同时间点血液拭子的适用性。结果表明，在血清样本中，两种ELISA均可自14 dpi开始检出CSFV抗体，当时3头有可用样本的动物中血清已出现阳性结果。但在对应血液拭子中，依据先前观察到的信号下降幅度，IDEXX CSFV Ab ELISA对其中1份14 dpi样本判定为阴性；而ID Screen CSF E2 Competition对该时间点所有对应样本均判定为阴性。相反，对于恢复期动物，即≥21 dpi采集的样本，两种ELISA均能够稳定、明确地检出抗体阳性。该结果表明，血液拭子在感染后早期的抗体检出能力有限，但在血清学转换完成后具有较好可用性。
由于欧盟近十年未发现CSF病例，研究缺乏来自自然感染野生猪属动物的现场样本。为此，研究人员采用野猪、疣猪和红河猪的阴性血液加入高滴度阳性血清，构建模拟阳性样本。结果显示，所有制备的血液拭子在两种ELISA中均可检出CSFV抗体阳性，并且不同稀释倍数所导致的信号变化在不同物种血液背景中表现一致。这一发现提示，野生猪属动物血液样本本身未显示出明显抑制性副作用，支持该方法在野生猪属动物样本中的应用潜力。
The application of blood samples in the VNT was tested as an example.
按照欧盟猪瘟诊断建议，ELISA可疑或阳性结果需通过VNT确认。研究人员选取1头家猪在实验感染后不同时间点的血清和血液拭子样本，分别以CSFV Diepholz和Alfort/187两株参考毒株开展VNT。结果显示，与血清相比，血液拭子检测到的中和抗体滴度较低，最多可降低至8倍以内，说明血液拭子在功能性抗体检测中同样存在一定敏感性损失。同时，由于实验感染毒株属于基因型2，采用同属基因型2.3的Diepholz毒株检测时获得的中和抗体滴度高于采用基因型1.1的Alfort/187时的滴度，这与抗原匹配性一致。试验过程中未观察到细胞毒性效应。与ELISA结果一致，≥21 dpi采集的血液拭子均可被可靠判定为中和抗体阳性。
讨论部分指出，在当前欧洲多国持续受ASF影响的背景下，野猪主动监测与被动监测均已成为动物卫生工作的重要组成部分，而CSF作为需重点鉴别的猪病之一，仍具有现实风险。尽管欧盟成员国目前保持CSF无疫状态，但日本在中断26年后于2018年再现疫情的事实表明，该病能够在长期平静后重新输入并扩散。因此，针对死亡野猪的便捷采样与实验室检测策略具有持续必要性。研究人员认为，干燥血液拭子在ASF诊断中的良好应用基础，为其扩展至CSF血清学检测提供了合理依据。本研究虽因缺乏野外自然感染样本、样本量较小而仅能作为概念验证，尚不足以替代大规模现场验证，但结果已经清楚显示：在感染后≥21 dpi阶段，血液拭子能够可靠检出CSFV抗体；而在感染早期，由于抗体浓度较低，血液拭子可能出现漏检。研究同时强调，CSFV体液免疫应答通常始于10–14 dpi，此阶段动物往往仍可检出病毒基因组，因此即使血液拭子在早期抗体检测中存在局限，仍可结合其在病毒核酸检测中的用途，提高总体监测效率。对于难以获取标准血清的死亡野猪样本，血液拭子是一种务实、便于猎人参与采样的策略，也有助于扩大监测覆盖面和送检数量。
研究结论部分可译为：综合来看，本研究结果表明，干燥血液拭子可作为单一样本基质，用于猪瘟（CSF）和非洲猪瘟（ASF）的鉴别诊断；但对于感染早期采集样本中的猪瘟抗体检测，其应用存在轻微局限。总体上，当无法获得优选样本基质血清时，血液拭子可作为检测CSFV抗体的可行替代方案，尤其适用于CSFV感染后≥21 d采集的样本。
从学术意义上看，该研究为野猪疫病监测提供了直接面向现场条件的样本学证据，扩展了血液拭子在猪瘟实验室诊断中的用途边界，并为在同一样本基质上联合开展CSF与ASF鉴别诊断提供了方法学基础。其核心价值不在于替代血清，而在于为无法取得血清的场景提供经过实验证实的补充性方案，从而增强野外监测体系的可操作性与现实适应性。
