由突变体引导的结构优化技术实现了第二代紧凑型IscB基因组编辑器的发展

《ChemBioChem》：Mutant-Initiated Structure-Guided Refinement Enables Second-Generation Compact IscB Genome Editors

摘要

像IscB这样的紧凑型RNA引导核酸酶是下一代基因组编辑工具的理想基础，但它们在哺乳动物细胞中的应用受到活性不足的限制。在这里，我们没有对酶进行重新设计，而是采用了一种基于突变的结构引导优化策略来开发第二代高活性IscB编辑器。利用AlphaFold3对工程化的IscB*-ωRNA–DNA复合物进行建模，我们发现活性增强替换改变了核酸结合界面。根据这一预测结构，我们进行了定向突变扫描，并确定V367位点是活性热点。在该位置进行饱和突变后，得到了一个替换突变V367Y（IscB*-Act），该突变使平均编辑效率提高了34%，在哺乳动物细胞中对内源性目标的编辑效果提升了多达2.1倍。重要的是，V367Y突变可以转移到基于IscB的腺嘌呤碱基编辑器上，平均使A到G的转换率提高了68%，在个别位点上甚至提高了4.46倍，同时不改变其固有的编辑窗口。针对目标位点的脱靶分析表明，V367Y突变并未显著增加脱靶插入或缺失或A到G的转换。综上所述，我们的工作展示了一种实用的第二代基因组编辑器优化框架，将深度学习驱动的结构预测与可解释的蛋白质工程相结合，扩展了微型IscB系统在核酸酶编辑和碱基编辑应用中的功能潜力。

图形摘要

通过对工程化IscB RNA引导核酸酶（IscB*）的结构引导扫描，确定了V367Y位点是活性热点。V367Y变体使得IscB*的核酸酶编辑能力增强，并且还能提升基于IscB的腺嘌呤碱基编辑器在哺乳动物细胞中的A到G转换率。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究相关的数据没有任何限制。所有与本文相关的原始数据均可在补充表2中找到。高通量测序数据已存入NCBI，访问代码为PRJNA1397368。