基于动力学模型的造血作用揭示干细胞谱系偏斜输出的外在调控

《Nature Cell Biology》：A kinetics-based model of haematopoiesis reveals extrinsic regulation of skewed lineage output from stem cells

　　

造血干/祖细胞（HSC）表现出广泛的分子和功能异质性。然而，能够解释这些多样化HSC状态之间关系及其生物学相关性的统一模型仍然难以建立。研究人员通过执行超过1000个高度纯化的小鼠长期造血干细胞（LT-HSC）的单细胞移植，并结合对其克隆后代的深度表型分析，确定了基于动力学的重建参数，这些参数将HSC排列成一条反映功能效能的单一层级轨迹。这种方法揭示，此前鉴定的谱系偏倚实际上是该线性轨迹上的瞬态，而非离散的稳定状态。单细胞二次移植验证了基于重建动力学的层级排序，而数学建模结合谱系偏倚血液生成的实验调控则揭示，显性谱系偏倚输出实际上源于细胞外在反馈调控以及慢速和快速定植克隆之间的克隆竞争，以将成熟谱系填充至其区室大小限制。本研究将多层次HSC异质性整合到一个统一的框架中。

造血干细胞（HSC）传统上被认为是一个均一的群体，具有一致的自我更新和多能特性。然而，过去二十年的大量研究揭示了该细胞区室内日益增加的功能和分子异质性谱系。移植研究表明，即使免疫表型均一的长效期（LT）-HSC区室内，个体HSC的定量和定性输出也存在高度异质性。多项研究报道了HSC在生成造血系统不同谱系方面存在显著偏倚，包括髓系和淋巴系偏倚输出，以及能够产生更平衡多谱系重建模式的个体HSC。更新的研究还鉴定了血小板偏倚的HSC，它们似乎位于造血层级的顶端。尽管对谱系偏倚的潜在机制已有一些见解，但对HSC区室中谱系偏倚的原因和后果的全面理解仍有待阐明。单细胞多组学分析也揭示了HSC广泛的分子异质性，与不同的干细胞特性和谱系偏倚模式相关。这些功能和分子研究共同挑战了经典的造血模型，但一个能够解释这些多种HSC亚型起源和相互关系的统一模型仍然难以建立。

在此背景下，发表于《Nature Cell Biology》的研究旨在克服传统方法的局限性。传统方法通过严格阈值应用于任意移植后时间点的成熟细胞后代比例来定义HSC功能效力和谱系偏倚，仅捕获了输出的有限快照，导致接受了离散的HSC亚型概念，而忽视了数据的连续性和HSC行为的广泛谱系。研究人员通过开展广泛的原代和序列二次单细胞移植，结合克隆系统的单细胞分子分析和数学建模，建立了一个统一框架，以阐明这些不同层次的分子和功能异质性之间的相互关系。

研究人员首先进行了超过1000个高度纯化的小鼠LT-HSC单细胞移植，并在移植后20周内对克隆来源的造血系统进行了全面表征。通过主成分分析（PCA），研究人员发现第一主成分区分了在造血干/祖细胞（HSPC）、红系、巨核细胞和髓系谱系中富集定植的克隆系统与主要产生淋巴系细胞类型的克隆系统。基于这一分析，研究人员粗略地将结果分为三个主要聚类：聚类1以骨髓中HSPC高嵌合度但成熟造血细胞嵌合度相对较低、强烈偏倚血小板和髓系输出为特征；聚类2表现出中等HSPC嵌合度和平衡的多谱系输出；聚类3以强烈淋巴系偏倚和骨髓中HSPC水平降低为特征。

重要的是，研究人员观察到三个聚类之间的异质性与外周血中不同的重建动力学相关。聚类1中的HSC以非常缓慢的速度补充血细胞，聚类2中的HSC具有强大的定植潜力并展示更快速的重建动力学，而聚类3中的HSC定植最快但随后血嵌合度下降。为了建立能够捕捉HSC区室功能异质性连续体的指标，研究人员推导了一个定量框架来描述LT-HSC的血液重建动力学，通过将每个谱系的定植数据拟合到单峰函数，提取了一系列动力学参数，包括移植后首次产生细胞进入外周血的延迟时间（t₀）、达到最大嵌合度所需时间（ty_Max）、从最大嵌合度下降至一半所需时间（t_Decline）等。

研究人员随后系统评估了HSC功能效力与重建动力学之间的关联。令人惊讶的是，传统的嵌合度依赖性参数与骨髓中HSC和祖细胞区室的再生程度仅显示有限的相关性。相比之下，所有时间依赖性动力学参数均显示出与干细胞特性相关HSPC再生的强相关性。这一发现在独立的验证队列中得到了进一步证实，该队列包含额外的278个单LT-HSC移植，通过将来自UBC-GFP小鼠和Kusabira Orange小鼠的单个HSC共移植到受体小鼠中。这一分析明确证明了时间依赖性重建参数与干细胞特性之间的关联，支持血液重建动力学是与高度纯化单LT-HSC移植后观察到的明显异质性输出密切相关的统一指标。

研究人员进一步探索了重建动力学与谱系偏倚血液生成之间的关系。通过按首次出现在外周血的顺序对所有成熟血细胞类型进行排名，发现在大多数克隆系统中，血小板最先产生，其次是髓系细胞，然后是淋巴系细胞。然而，从快速到慢速重建的克隆系统，血小板生成开始与其他谱系产生之间的延迟逐渐增加。快速克隆系统在所有谱系中显示出早期的外周血细胞输出爆发，随后嵌合度迅速下降。由于淋巴系细胞具有更长的半衰期，因此在HSC区室耗竭后持续更长时间，这些快速克隆系统随时间推移显得越来越淋巴系偏倚。相比之下，具有较高t₀值的系统在早期时间点显得髓系偏倚，然后进展到更平衡的成熟细胞输出。

为深入理解时间分辨率下的谱系偏斜输出如何与骨髓造血相关，研究人员对五个代表性克隆系统进行了基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。组成和轨迹分析显示，谱系偏斜的血液生成和可变重建动力学在收集时点的HSPC区室中有所反映。最慢重建的克隆（克隆I）主要产生血小板，在巨核细胞祖细胞区室中保留了大量后代，而淋巴系祖细胞和成熟淋巴系细胞高度代表性不足。随着重建动力学的加快，克隆系统显示出相对丰度的渐进性转变，从红系-髓系谱系为主转变为淋巴系谱系占多数。这些发现与慢分化HSC克隆更好地再生HSPC区室、最初产生血小板和髓系偏斜后代、并随着重建动力学增加和自我更新能力下降而渐进过渡到平衡和淋巴系偏倚结果的模型一致。

为了验证重建动力学和谱系偏倚之间的推定联系，研究人员查询了深度免疫表型分析的发现队列。通过将谱系定向祖细胞按其与HSC的Pearson相关距离顺时针排序，生成了HSPC区室的时钟样表示。将所有22个具有持续定植的发现队列克隆系统沿此"时钟"框架排列后，观察到个体克隆系统的动力学参数与HSPC过渡时间之间存在强烈的负相关，证明了快速重建系统在分析时间点已比慢速重建系统在该伪时间时钟上过渡得更远。

研究人员开发了数学模型来研究慢速和快速定植HSC克隆之间的层级关系。该模型成功再现了移植后血细胞的顺序产生以及不同血液生成动力学相关的谱系偏倚。具体而言，慢系统源于移植的HSC填充上游区室，而快系统则由主要填充下游区室的HSC驱动。为了在实验环境中验证该模型，研究人员进行了费力的连续单细胞移植，选择六个显示稳健HSPC区室嵌合度的原代受体，收集其单个HSC并重新移植525个单个子代细胞到二次受体中。考虑整个二次移植队列时，女儿HSC在 ???? any时间点具有可检测外周血定植的百分比从原代受体的36.3%下降到二次受体的9.9%，而具有长期定植能力的克隆百分比从24.8%急剧下降到2.6%。引人注目的是，除一个外，所有500多个重新移植的HSC（99.8%）与其亲代HSC相比，在移植后第24周显示出降低的嵌合度水平。几乎所有女儿HSC与其前体克隆相比均表现出效力下降，表明在移植背景下完全自我更新是非常罕见的事件。重要的是，女儿克隆系统在所有参数上与其各自的亲代相比均表现出显著加速的动力学，几乎所有女儿干细胞还单向地从髓系偏倚转变为更淋巴系偏倚的血液生成，与先前将更快重建动力学与该谱系输出转变联系起来的数据一致。在极少数情况下，女儿克隆与其亲代相比保持了基于重建动力学的参数，这与HSPC区室的高自我更新以及二次移植终点分析中髓系-淋巴系比例的维持相关。

基于上述发现，研究人员进一步探索了克隆竞争对谱系偏倚输出的外在调控机制。研究人员利用数学模型模拟了LT-HSC输出可能受更成熟细胞水平调控的过程，设计了两种互斥模型：模型1缺乏反馈调控，而模型2纳入了负反馈设定的区室大小限制。实验数据显示模型2与实验数据的一致性远优于模型1，表明尽管个体HSC来源的造血系统贡献存在变异，成熟造血细胞的产生仍受到稳态反馈机制的严格限制，以强制执行严格的区室大小限制。基于区室大小限制的概念，研究人员假设移植的单个HSC克隆的补充可能受到竞争HSC克隆的影响。通过量化由移植的单LT-HSC与同一小鼠中共移植的支持性骨髓产生的成熟血细胞的绝对水平，观察到单LT-HSC产生的成熟细胞与支持性骨髓之间存在严格的负相关，支持了反馈调控限制成熟血细胞区室大小以及慢速和快速重建克隆之间的竞争可能以细胞外在方式促成谱系偏倚建立的模型。

为验证克隆竞争与谱系输出之间的假设联系，研究人员利用荧光蛋白标记的慢病毒条形码库（LARRY）进行了条形码移植实验。通过将纯化的HSC池转导后批量移植到受体小鼠中，利用独特的克隆条形码计算了每个受体的定植HSC克隆数量，并将其与所有克隆的平均巨核细胞/髓系或淋巴系偏倚水平进行比较。正如竞争模型预测的那样，观察到定植HSC克隆数量与巨核细胞/髓系命运的比例实现之间存在强烈的正相关，与淋巴系偏斜输出的比例呈负相关，为细胞外在竞争可以调节多能HSC的谱系偏斜输出提供了证据。

为进一步验证快速和慢速克隆之间的竞争驱动谱系偏斜输出的预测，研究人员利用了Rag2敲除（Rag2^-/-）小鼠模型，其HSC能够进行红系-髓系重建但缺乏产生成熟淋巴系细胞的能力。将野生型LT-HSC与Rag2^-/-支持性骨髓细胞一起移植到Rag2^-/-受体小鼠中，观察到慢速克隆表现出依赖于细胞外在环境的谱系输出变化：与淋巴系能力竞争者共移植的慢速克隆显示出明显的髓系偏倚，而移植到Rag2^-/-造血系统中的克隆则未表现出相同的谱系偏斜，打破了淋巴系输出程度与基于动力学的参数（如t₀）之间的反向相关性。相比之下，快速克隆的谱系偏倚未被改变，与这些克隆首先填充区室大小因此受已建立成熟细胞竞争反馈影响较小的概念一致。这些发现表明，基于动力学的重建参数与明显髓系偏倚之间的联系可以通过调节竞争者HSPC填充成熟淋巴系谱系的能力来解耦。

在讨论部分，研究人员指出，众多研究使用单细胞移植描述了原始HSC池内的功能异质性，但关于这些多样化表型结局代表分支层级中的离散中间体还是线性轨迹上的细胞状态一直缺乏清晰认识。通过摒弃根据任意阈值和时间点对HSC进行经典亚分类的方法，将功能异质性结局沿连续的动力学尺度排列，为根据自我更新能力分配效力提供了框架。这使研究人员能够综合解释为什么最有潜力的HSC在首次贡献于成熟血细胞生产时主要产生血小板和髓系后代，尽管它们是多能的。慢定植克隆的谱系偏斜输出受更快速定植竞争者克隆成熟后代的外在反馈驱动，这一发现将克隆输出的变异性与成熟血细胞的系统需求联系起来。

研究人员进一步指出，基于动力学的功能层级与其他支持连续波HSC克隆贡献于成熟血细胞产生的移植研究一致，其中持续定植和HSC池再生由慢速或低输出克隆支持。然而，这种层级如何与天然造血环境相关仍不清楚。一个可能立即相关的领域是衰老过程中髓系偏倚HSC的积累，这已被归因于从骨髓系恶性肿瘤演变到免疫功能失调等多种年龄相关病理过程的根本原因。研究人员推测，衰老可能导致具有延迟动力学的多能HSC进行性积累，因此在移植后显得髓系偏倚，这种表型甚至可能在衰老过程中被选择。

本研究所采用的关键技术方法主要包括：小鼠单细胞移植模型（使用C57BL/6J、UBC-GFP、Kusabira Orange和Rag2^-/-小鼠品系）；基于流式细胞术的深度免疫表型分析（使用37种免疫表型标记表征55种不同的HSC来源细胞群体）；单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（使用Chromium Single Cell 3'试剂盒，Seurat和LIGER进行数据整合，Slingshot进行伪时间分析）；数学建模与参数拟合（使用ModelFitter包进行单峰函数拟合，Turing.jl进行贝叶斯推断，以及使用COPASI构建常微分方程模型模拟HSPC动力学）；线性/反馈区室模型模拟；以及LARRY条形码库结合scRNA-seq的克隆竞争实验。