基于相关冷冻电子显微术与质谱成像的亚细胞化学图谱绘制

《Nature Methods》：Subcellular chemical mapping using correlated cryogenic electron and mass spectrometry imaging

　　

电子冷冻显微术（cryo-EM）能够以高空间分辨率可视化生物样本；然而，对cryo-EM中观察到的密度进行化学鉴定仍具挑战性。为克服这一问题，研究人员将cryo-EM与基于聚焦离子束二次离子质谱（focused ion beam secondary ion mass spectrometry, FIB-SIMS）的化学成像相结合，用于未标记样本的整合式空间-化学（spatiochemical）分析。研究显示，该相关工作流程能够实现细菌细胞内分子的亚细胞定位，并且与冷冻光学显微镜（cryo-light microscopy, cryo-LM）以及真核样本的聚焦离子束铣削薄片（FIB-milled lamellae）兼容。为凸显该流程所带来的生物学洞见，研究人员考察了广泛存在的化学污染物双酚-AF（bisphenol-AF, BPAF）被环境细菌摄取的过程，揭示这些化学物质储存在受污染物暴露细胞的细胞质相分离聚集体内，并且尽管细菌外排机制（efflux machinery）发生了强烈上调，仍无法将其清除。因此，cryo-EM-FIB-SIMS代表了一种能够在近天然态（near-native）生物样本中绘制元素与分子特征图谱的有效方法。

该论文发表于《Nature Methods》，核心贡献是建立了一种将冷冻电子显微术（cryo-EM）与聚焦离子束二次离子质谱成像（FIB-SIMS）耦合的相关成像流程，从而在近天然玻璃化状态样本中同时获得超微结构信息与化学组成信息，推动亚细胞尺度“看见结构但难以识别化学身份”的长期难题获得方法学解决。传统cryo-EM可对蛋白复合体、细胞与组织提供极高空间分辨率，但电子显微图中的密度本身并不直接对应确定的化学种类，因此在复杂细胞环境中，不同分子、离子或污染物往往难以区分。相较之下，质谱（MS）具有直接化学特异性，尤其二次离子质谱（SIMS）可在像素层面对样本进行逐点离子化并输出空间分布信息，但其单独使用时又受限于空间解析度、样本几何与结构上下文缺失。正因为结构分辨与化学分辨长期分离，研究人员开展本研究，以建立能够跨模态整合超微结构和分子/元素定位的成像策略。

研究人员开发了低温条件下适用于玻璃化生物样本的cryo-EM-FIB-SIMS工作流程。该流程先获取二维cryo-EM图像，再将同一区域转移至低温FIB-SIMS仪器进行质谱成像，并利用FIB产生的次级电子图像与cryo-EM图像进行配准叠加，实现结构信息与化学信息相关分析。研究不仅在带标记和未标记细菌样本中完成了原理验证，还进一步证明该流程可与冷冻光学显微镜（cryo-LM）整合，也适用于经FIB铣削获得薄片的厚样本，包括细菌层片和真核细胞层片。通过这一平台，研究人员进一步解析了环境细菌对含氟污染物双酚-AF（BPAF）的摄取与胞内归趋，发现BPAF在细胞内并非均匀分布，而是集中蓄积于细胞质中的储存颗粒样相分离聚集体内；与此同时，细菌药物外排泵显著上调，却仍无法有效移除这些污染物。研究由此表明，cryo-EM-FIB-SIMS可在亚细胞尺度直接揭示化学物质在细胞中的空间归属及其生物学后果。

方法概括而言，研究主要采用以下关键技术：其一，在玻璃化样本上顺序实施二维cryo-EM与低温FIB-SIMS，并通过次级电子图像完成跨模态配准；其二，结合正、负离子模式采集不同m/z离子信号，实现元素、小分子及同位素相关成像；其三，将该流程扩展到cryo-LM引导的相关光镜-电镜-质谱成像（cryo-CLEM-FIB-SIMS）以及FIB铣削薄片成像；其四，在BPAF研究中结合液相色谱-质谱（LC–MS）生物累积定量与TMT蛋白质组学分析。样本来源包括Caulobacter crescentus、Bacteroides thetaiotaomicron、Pseudomonas aeruginosa、Saccharomyces cerevisiae及BPAF暴露的环境细菌培养体系。

在“Integrated cryo-EM and FIB-SIMS imaging workflow”部分，研究人员首先建立并验证了相关成像工作流程。具体而言，样本先经cryo-EM获取细胞形态与超微结构，再转移至配备飞行时间质量分析器（time-of-flight, ToF）的低温FIB-SEM中实施SIMS成像。Ga离子束逐像素烧蚀样本并提取次级离子，每个像素对应一张质量谱，最终形成二维乃至三维化学信息矩阵。研究还通过样本背面施加有机金属涂层改善传输稳定性和信号质量。以玻璃化CsI与水样为标准样品，系统检测到预期离子峰；在金纳米颗粒标记的Caulobacter crescentus中，cryo-EM可见细胞表面金颗粒，cryo-FIB-SIMS则在197 m/z处检测到与细胞共定位的Au信号，证实该流程能够在同一样本上同时提供结构与化学证据。进一步，研究人员在Bacteroides thetaiotaomicron中利用¹³C标记淀粉验证了同位素追踪能力，检测到¹³C及¹³CN信号，提示被摄取底物已转化为含碳、含氮有机分子。这一部分说明该流程既适用于重金属标记，也兼容稳定同位素标记。

在“Correlative spatiochemical imaging of bacterial cells at subcellular resolution”部分，研究人员转向未标记细菌样本，展示该方法对天然细胞化学异质性的解析能力。以未标记的Caulobacter crescentus为对象，cryo-EM清晰显示内膜（IM）、外膜（OM）、S层（SL）以及胞内储存颗粒（SGs）等结构。将不同m/z离子峰对应的FIB-SIMS图谱叠加到cryo-EM图像后可见，不同离子在细胞内分布并不相同：Na在细胞质中较为弥散，Mg主要紧密富集于储存颗粒，而K既存在于细胞质中，也在储存颗粒中形成突出峰值。负离子模式进一步显示储存颗粒富含PO₂与PO₃相关磷酸盐信号。依据文中归纳，这些结果支持储存颗粒含有多聚磷酸盐，并伴随K、Mg等对离子富集。该部分证明，对于未加外源标记的细胞，cryo-EM-FIB-SIMS同样能够达到亚细胞级化学定位。

在“Cryo-EM-FIB-SIMS is compatible with cryo-LM as well as FIB-milled lamellae”部分，研究重点在于展示方法的平台兼容性与通用性。首先，研究人员利用SpyCatcher-SpyTag体系将Caulobacter crescentus的S层分别标记为绿色荧光蛋白（GFP）或单体红色荧光蛋白（mRFP），并仅对mRFP组附加金纳米颗粒。三种成像模式中，同一细胞群体可分别通过荧光颜色、EM中金颗粒可见性和SIMS中Au信号加以区分，证明cryo-LM、cryo-EM与cryo-FIB-SIMS可构成完整的cryo-CLEM-FIB-SIMS流程。其次，研究人员将流程扩展至FIB铣削薄片。对Pseudomonas aeruginosa浓缩样本制备层片后，cryo-FIB-SIMS图像中可识别单个细胞，并能与概览cryo-EM及高分辨冷冻电子断层成像（cryo-ET）切片相关联。对于酵母Saccharomyces cerevisiae层片，研究显示K、Na主要位于细胞质，而Mg更多出现于胞内区室。虽然作者未作深入生物学阐释，但已充分证明该方法适用于较厚样本和真核细胞。

在“Tracking the accumulation of pollutants in environmental bacteria using cryo-EM-FIB-SIMS”部分，研究进入生物学应用验证。研究对象为塑料生产相关含氟环境污染物BPAF及其在Caulobacter crescentus中的积累行为。由于BPAF含氟，可在负离子模式下利用F信号（19 m/z）进行追踪。生长实验显示，BPAF暴露会显著延缓细菌生长，无论是在低OD₆₀₀阶段还是指数生长期加入均如此。LC–MS生物累积分析显示，暴露后细胞沉淀中的BPAF浓度明显高于上清，证明细菌发生了实质性摄取和累积；这一现象在PBS与耗尽培养基中均可观察到。与此同时，基于TMT的蛋白质组学分析表明，BPAF暴露在15 min至24 h各时间点均导致蛋白丰度谱发生系统性变化。主成分分析（PCA）显示暴露组与未暴露组沿不同主成分分离，提示BPAF引起独立而明确的蛋白质组重塑。尤其值得注意的是，多种药物外排泵及其调控蛋白如acrB2和TipR显著上调，说明细菌感知到胞内污染物负荷并启动外排应答，但结合生物累积结果可知，这种应答并未阻止BPAF在细胞内高水平存留。

在对BPAF胞内定位的进一步解析中，cryo-EM-FIB-SIMS提供了决定性证据。暴露100 μM BPAF 4 h后的细胞cryo-EM图像中可见两类胞质聚集体：一类为中等对比度、球形、类似储存颗粒的结构；另一类为高对比度、不规则聚集体。对同一细胞实施cryo-FIB-SIMS后，氟信号呈高度局灶性分布，而未暴露对照几乎不显示特异性氟信号。将cryo-EM与氟信号叠加后发现，BPAF相关氟信号与储存颗粒样结构共定位，而细胞质其他区域及高对比度不规则聚集体不表现出局部氟富集。统计分析覆盖162个暴露细胞，支持这一结论具有稳健性。进一步地，储存颗粒直径在BPAF暴露组显著增大，平均为206.9 ± 38.5 nm，而对照组为186.4 ± 37.9 nm，差异具有统计学意义。结合外排泵上调这一现象，研究人员据此认为BPAF在进入细胞后被隔离于储存颗粒样相分离聚集体中，从而降低细胞质中的游离浓度，但这种隔离同时也使其难以被外排系统清除。2 h和24 h暴露样本中同样观察到明显的局部聚集，说明BPAF摄取发生迅速且在细胞内滞留时间较长。

讨论部分强调，该研究建立的cryo-EM-FIB-SIMS流程具有模块化和可扩展性，适用于未标记细菌、荧光/金属双标记细菌以及真核样本，并可嵌入更大的相关光电成像框架。其在方法学上的重要意义在于，把cryo-EM的高空间分辨率与SIMS对元素、同位素和部分小分子片段的化学特异性结合起来，使研究者能够在近天然态样本中直接进行亚细胞化学测绘。文章同时将该方法置于空间化学成像技术谱系中，与电子能量损失谱（electron energy loss spectroscopy, EELS）、能量色散X射线谱（energy dispersive X-ray spectroscopy, EDX）等技术进行比较，指出SIMS的优势在于既能检测元素，也能检测分子和同位素离子，而局限则包括离子化产额较低、可检测大分子范围有限、Ga束横向分辨率与相互作用深度之间存在权衡。作者还指出，未来若引入更大离子束如气体团簇离子束（gas cluster ion beams），有望拓展到肽、脂质和药物分子的检测，但可能牺牲横向空间分辨率。总体而言，论文认为，高空间分辨与高化学分辨的结合将是理解复杂生物样本分子组织原则的重要方向。

研究结论部分可译为：研究人员报道了一种cryo-EM-FIB-SIMS工作流程，可在多种样本中以模块化方式应用，包括未标记细菌、荧光标记细菌以及真核样本。该流程通过整合多种成像模态，能够实现分子在亚细胞尺度（在真核中可至亚细胞器尺度）的定位，并支持对局部形态与化学组成进行定点探索。在本研究中，研究人员利用该方法解析了环境细菌对含氟污染物的摄取问题，证明相关空间-化学成像能够有效揭示机制性生物学过程。研究结果表明，cryo-EM-FIB-SIMS是一种能够在近天然生物样本中绘制元素和分子特征的有效手段，并为复杂生物体系的综合分子理解提供了新的技术基础。