《Synthetic and Systems Biotechnology》：Enhanced production of l-histidine in Escherichia coli through systematic metabolic engineering and CER controlled fermentation
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L-组氨酸是一种必需氨基酸，广泛应用于医药和营养领域，因此开发高效的微生物生产平台具有重要意义。本研究通过系统代谢工程构建了高性能大肠杆菌细胞工厂。研究人员首先挖掘出一种反馈抑制不敏感的hisG*smar及其所在的突变型his操纵子，来源于此前获得的一株高产L
L-组氨酸是一种必需氨基酸，广泛应用于医药和营养领域，因此开发高效的微生物生产平台具有重要意义。本研究通过系统代谢工程构建了高性能大肠杆菌细胞工厂。研究人员首先挖掘出一种反馈抑制不敏感的hisG*smar及其所在的突变型his操纵子，来源于此前获得的一株高产L-组氨酸的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)突变株，为途径酶提供了非常规来源的新元件。结合前体供应增强与氧化还原平衡优化，工程菌株摇瓶产量达到4.46 g/L。随后，利用基于机器学习的TransDW平台预测并验证了新型外排转运蛋白Cgl1374，将产量提升至4.82 g/L。进一步引入生长阶段依赖型启动子系统动态调控pgi基因表达，重新分配碳通量，摇瓶产量达5.49 g/L。最终，在5 L生物反应器中采用新型碳演化速率(carbon evolution rate, CER)控制策略，优化菌株的产量达到49.8 g/L，葡萄糖得率为0.265 g/g，为目前已报道的工程大肠杆菌最高得率。该研究建立了非模式基因挖掘、计算转运蛋白工程与实时生理反馈控制相结合的协同框架，为新一代微生物细胞工厂提供了通用蓝图。
L-组氨酸(L-histidine, His)作为必需氨基酸，在营养补充剂、动物饲料及制药领域具有重要应用价值，其衍生物参与免疫调节、癌症与帕金森病治疗，并在单克隆抗体药物配方中用作稳定剂。传统化学合成法存在外消旋混合物及环境污染问题，蛋白质水解法受限于天然蛋白资源，因此微生物发酵成为可持续且经济的替代路径。L-组氨酸的生物合成途径广泛存在于细菌、真菌及古菌中，以磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)为前体，经his操纵子编码的九个酶催化的十步反应生成，并受到终产物反馈抑制及转录衰减的双重调控。尽管已有在大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)及粘质沙雷氏菌中生产L-组氨酸的研究，但仍面临三大瓶颈：一是多数his操纵子来源于模式菌株，非模式工业突变株的优良遗传性状尚未充分挖掘；二是缺乏高效的特异性外排转运蛋白；三是发酵过程控制依赖溶解氧(DO)或pH等间接参数，无法实时匹配细胞代谢活性。为此，研究人员结合比较基因组学、代谢工程与先进过程控制，旨在构建高效、稳定的L-组氨酸细胞工厂。
研究中，主要关键技术包括：(1) 对高产L-组氨酸的粘质沙雷氏菌CGMCC 19116进行全基因组重测序，鉴定his操纵子关键突变；(2) 利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，将突变基因整合至大肠杆菌MG1655基因组；(3) 应用TransDW机器学习平台预测并验证L-组氨酸外排转运蛋白；(4) 构建生长阶段依赖型启动子系统实现pgi基因的动态调控；(5) 建立基于碳演化速率(CER)的补料分批发酵控制策略。
3.1 粘质沙雷氏菌高产突变株his操纵子的突变鉴定
通过对ARTP诱变获得的高产菌株CGMCC 19116进行三代与二代混合测序，并与野生型SM39基因组比对，发现his操纵子中所有九个基因均存在非同义突变或插入，这些突变可能通过改变酶活性解除反馈抑制，为大肠杆菌途径优化提供了新元件。
3.2 大肠杆菌核心合成途径改造
筛选反馈抑制不敏感的HisG变体，其中hisG*smar表现出最高的摇瓶产量及更强的抗反馈压力能力。通过敲除purR、过表达prs及磷酸戊糖途径(PPP)关键基因zwf与gnd，显著增强了PRPP前体供应，提升了产量与菌体生长。逐步整合并过表达来自粘质沙雷氏菌的下游his操纵子基因，使产量累积提升至3.22 g/L。
3.3 谷氨酸前体再生与辅因子平衡
引入枯草芽孢杆菌rocG基因构建谷氨酸再生循环，缓解HisC转氨步骤的前体不足；同时共表达pntAB与sthA构建双向转氢系统，平衡NADH与NADPH供给，最终产量达4.46 g/L。
3.4 计算预测与验证L-组氨酸外排转运蛋白
TransDW平台筛选出三个候选转运蛋白，实验验证表明Cgl1374的外排效率最高，产量提升至4.82 g/L，并显著降低胞内L-组氨酸积累。
3.5 pgi的动态调控与碳通量重定向
完全敲除pgi导致生长与生产严重受损，改用生长阶段依赖型启动子调控pgi表达，可在指数期维持生长，在稳定期将碳流导向PPP及产物合成，最优菌株摇瓶产量达5.49 g/L。
3.6 基于CER的补料分批发酵优化
在5 L生物反应器中，以CER为实时控制参数调节补糖与通气策略。中等CER设定值(80 mmol/L/h)实现了最佳的生长与产物合成平衡，产量达49.8 g/L，葡萄糖得率0.265 g/g，并有效抑制了乙酸溢出效应。
3.7 比较分析与策略创新
与已有研究相比，本研究首次将非模式菌株基因组挖掘、机器学习驱动的转运蛋白发现及CER实时控制相结合，实现了目前报道的工程大肠杆菌最高葡萄糖转化率，提供了可推广的代谢工程框架。
结论
本研究整合比较基因组学、代谢工程与过程优化，成功构建了一株高效生产L-组氨酸的大肠杆菌细胞工厂。通过引入粘质沙雷氏菌的反馈抑制不敏感突变、优化前体与辅因子供应、验证新型转运蛋白Cgl1374、实施pgi动态调控及CER指导的发酵控制，实现了49.8 g/L的产量与0.265 g/g葡萄糖得率。该工作为微生物细胞工厂的理性设计与规模化生产提供了实用策略与通用方法。
