《Veterinary and Animal Science》：Development of hexaplex PCR assay for the detection and characterization common tick-borne pathogens in dogs, and analysis of risk factors
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本研究旨在开发并验证一种含内部对照的六重聚合酶链式反应（hexaplex PCR）检测方法，用于同步检测并区分印度奥里萨邦8个选定地区犬只中5种主要蜱传病原体（tick-borne pathogens, TBP），分别为犬埃立希体（Ehrlichia cani
本研究旨在开发并验证一种含内部对照的六重聚合酶链式反应（hexaplex PCR）检测方法，用于同步检测并区分印度奥里萨邦8个选定地区犬只中5种主要蜱传病原体（tick-borne pathogens, TBP），分别为犬埃立希体（Ehrlichia canis）、吉氏巴贝斯虫（Babesia gibsoni）、韦氏巴贝斯虫（Babesia vogeli）、犬肝簇虫（Hepatozoon canis）及血小板无形体（Anaplasma platys）。该检测体系针对各病原体的特异性基因片段进行扩增：E. canis靶向16S核糖体RNA（16S rRNA）基因，扩增产物长度为817 bp；B. vogeli与B. gibsoni、H. canis均靶向18S核糖体RNA（18S rRNA）基因，扩增产物长度分别为602 bp、489 bp和737 bp；A. platys靶向热休克蛋白GroEL（HSP GroEL）基因，扩增产物长度为292 bp。同时，体系引入犬β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内部扩增对照（internal amplification control, IAC），扩增产物长度为218 bp，以排除假阴性结果。该方法与单重PCR（singleplex PCR）相比，诊断特异性和敏感性经kappa值评估显示一致性极佳（n=61）。分析敏感性结果显示，多重PCR对A. platys、H. canis及B. vogeli的检测下限为0.1 pg，对E. canis和B. gibsoni的检测下限为10 pg。对320份样本的流行病学调查显示，蜱传病原体总感染率为31.56%；H. canis与B. gibsoni感染率在夏季最高，A. platys感染率在雨季最高；共感染会加剧临床病症。本研究获得的奥里萨邦分离株序列与全球已发表分离株的同源性达98%–100%。研究人员认为，该标准化多重PCR是一种快速、经济且灵敏的诊断工具，可用于犬蜱传血液寄生虫病的识别。
研究背景与意义
印度拥有庞大的犬只种群，其热带气候与高湿度环境极利于媒介蜱类的生存繁殖。褐狗蜱（Rhipicephalus sanguineus）作为主要传播媒介，可携带多种病原，包括巴贝斯虫病、肝簇虫病、埃立希体病和无形体病等。这些病原体常因共享同一媒介而导致犬只发生共感染，显著增加了临床诊断与治疗的复杂性。传统的外周血涂片显微镜检查灵敏度低，难以检出低载量感染或慢性带虫状态；血清学方法则存在交叉反应及无法区分既往与现症感染的局限。虽然核酸检测技术已被广泛应用，但现有的多重PCR（multiplex PCR, mPCR）检测往往缺乏内部扩增对照（IAC），易因扩增抑制导致假阴性，且在印度奥里萨邦地区缺乏针对上述五种主要病原的系统分子流行病学数据。为此，研究人员开展此项研究，旨在填补这一空白，并开发一种高效的诊断工具。该研究发表于《Veterinary and Animal Science》。
关键技术方法
研究人员于2024年在印度奥里萨邦沿海8个地区开展了一项横断面研究，共采集320只有蜱虫暴露史或出现相关临床症状的犬只全血样本。样本采集自奥里萨邦农业大学兽医临床中心。研究采用常规外周血涂片姬姆萨染色镜检作为初筛。分子检测方面，首先分别优化针对E. canis（16S rRNA）、B. gibsoni（18S rRNA）、B. vogeli（18S rRNA）、H. canis（18S rRNA）、A. platys（HSP GroEL）及犬β-actin基因的单重PCR体系。在此基础上，通过优化引物浓度与退火温度，成功构建包含内部扩增对照（IAC）的六重PCR（hexaplex PCR）体系。随后，研究人员通过梯度稀释标准品评估分析敏感性，并利用61份田间样本评估该方法的诊断敏感性与特异性（以单重PCR为标准）。此外，对部分扩增阳性产物进行测序，利用MEGA软件进行多序列比对与基于最大似然法（Maximum Likelihood）的系统发育分析。统计学分析采用SPSS软件进行卡方检验与多因素Logistic回归分析，以确定感染相关的风险因素。
研究结果
3.1 显微镜检查结果
对320份样本的血涂片镜检显示，蜱传病原体的总体检出率为12%。其中吉氏巴贝斯虫（B. gibsoni）感染率最高（8.1%），韦氏巴贝斯虫（B. vogeli）最低（0.3%）。镜检未观察到共感染病例。
3.2 单重与多重PCR的分析敏感性
六重PCR体系能够特异性地同时扩增出预期的五个目标片段及内参片段，无非特异性扩增。分析敏感性测试表明，单重PCR对A. platys、B. gibsoni、E. canis和B. vogeli的检测下限可达0.01 pg；而在六重体系中，A. platys、B. vogeli和H. canis的检测下限为0.1 pg，E. canis和B. gibsoni为10 pg。
3.3 诊断敏感性与特异性评估
利用对照样本和61份田间样本验证显示，该六重PCR的诊断特异性与敏感性均为100%。在田间样本验证中，其对A. platys、B. gibsoni、E. canis、H. canis和B. vogeli的诊断敏感性分别为90.5%、94.12%、87.5%、83.33%和100%；特异性除A. platys（97.5%）和H. canis（98.18%）外，其余均为100%。McNemar检验显示六重PCR与单重PCR结果无显著差异（P > 0.05），Kappa值证实两者具有极好的一致性。
3.4 多重PCR的田间评估
应用六重PCR检测320份样本，总感染率提升至31.56%，远高于镜检结果。单一感染占20.93%，共感染占10.62%。分子水平上，A. platys的总体流行率最高（16.3%），其次为B. gibsoni（14.4%）。共感染形式主要为双重感染（9.4%），三重感染占1.2%。
3.5 多重PCR分析与风险因素
统计分析显示，不同地区间的感染率无显著差异，但Khordha地区的B. gibsoni感染风险显著升高。季节性分析表明，B. gibsoni和H. canis在夏季高发，A. platys在雨季高发，而E. canis和B. vogeli无明显季节性差异。风险因素分析证实，蜱虫寄生、未进行驱蜱治疗以及有限的户外活动是感染的主要风险因素。年龄小于1岁的幼犬对B. vogeli更易感。品种、性别对感染率无显著影响。
3.6 临床状态分析
单重感染中，B. gibsoni导致的临床症状比例最高（64%），而H. canis无症状比例最高（66.7%）。共感染显著加重疾病严重程度，三重感染病例均表现出明显的临床症状。
3.7 系统发育分析
测序及同源性分析显示，奥里萨邦分离株与全球不同地区的参考株同源性高达99%–100%。系统发育树显示，所有分离株均与其对应的物种形成独立分支，与近缘种界限清晰，证实了鉴定结果的准确性。
讨论与结论总结
讨论部分指出，这是首次在奥里萨邦开发并应用含内部对照的六重PCR检测五种犬蜱传病原。相较于昂贵的实时荧光定量PCR（qPCR），这种常规终点法多重PCR在资源有限的环境中更具成本效益。研究证实，引入IAC能有效监控扩增失败，减少假阴性。与显微镜检查相比，分子检测大幅提高了亚临床感染和共感染的检出率，纠正了以往认为B. gibsoni是最主要病原的认知，证实A. platys在当地流行更为广泛。地理差异可能与气候、宿主及媒介分布有关。研究发现共感染普遍且加重病理损害，强调了多重检测的重要性。风险因素分析支持了定期驱蜱和限制户外活动的防控策略。
结论部分翻译：本研究成功开发并标准化了一种六重PCR检测方法，可同步检测并区分犬只中五种主要的蜱传血液寄生虫，并以犬β-肌动蛋白基因为内部扩增对照。该方法分析灵敏度高，能稳定检测到0.1–10 pg的病原体DNA。流行病学调查显示，A. platys是该地区流行率最高的病原体，B. gibsoni在Khordha地区流行率较高，且H. canis和B. gibsoni在夏季多发，A. platys在雨季多发。共感染会加重疾病严重程度。系统发育分析表明该地区病原体基因序列稳定，未出现明显遗传分化。该六重PCR是一种快速、可靠且灵敏的工具，适用于临床样本的高通量筛查及大规模流行病学调查，可为制定循证的犬蜱传感染防控策略提供依据。
