基于常规PCR与实时荧光定量PCR的沙门菌属检测方法建立

《Veterinary and Animal Science》：Establishment of methods for the detection of Salmonella species by conventional and quantitative real-time PCR

本研究旨在建立一种针对沙门菌属（Salmonella spp.）的高特异性、高灵敏度检测方法，分别基于常规PCR与实时荧光定量PCR（qPCR）技术，并在临床及动物样本中验证其适用性。研究人员首先针对沙门菌属特异性基因STM1410设计引物与探针，并对退火温度、引物浓度及探针浓度进行系统优化。随后利用该方法对临床样本进行检测，评估其特异性、稳定性与灵敏度。结果显示，两种PCR方法均可成功检出15种不同血清型沙门菌的基因组，而对8种常见其他病原菌及阴性对照均未检出，证实方法具有高特异性。常规PCR的最低检测限为5×101拷贝/μL，qPCR最低检测限为5×100拷贝/μL，均表现出高灵敏度。qPCR重复性试验显示组内与组间变异系数（CV）均小于3%，表明方法稳定性优异。在对60份临床样本的检测中，常规PCR阳性率为29/60（48.3%），TaqMan qPCR阳性率为32/60（53.3%）。本研究建立的常规PCR与TaqMan qPCR方法靶向沙门菌属特异序列STM1410基因，可有效应用于临床检测与食品卫生监测，对促进健康养殖与保障食品安全具有重要意义。

《Veterinary and Animal Science》刊登了由山东农业大学刘宁宁、刘聪等研究人员完成的一项关于沙门菌属（Salmonella spp.）检测技术的研究。沙门菌是全球最重要的食源性致病菌之一，目前已发现超过2600种血清型，在我国已报告292种，其中肠炎沙门菌（Salmonella enteritidis）与鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）在亚洲及我国均为优势流行株。该病原广泛存在于畜禽养殖链条中，可通过受污染的动物源性食品传播给人类，每年给畜牧业、食品加工业造成巨大经济损失，并带来严重的公共卫生风险。传统沙门菌分离鉴定流程复杂、耗时长，环介导等温扩增（LAMP）易污染导致假阳性，酶联免疫吸附试验（ELISA）灵敏度不足且操作要求高，免疫层析法（ICA）灵敏度低且无法定量，胶体金免疫技术（ICGT）制备复杂且易受环境干扰，这些局限性凸显了开发快速、准确检测方法的必要性。以往常用的靶基因如invA、fimA、stn等存在血清型覆盖不全或特异性不足的问题，因此研究人员选择STM1410基因作为检测靶点，旨在建立特异性强、灵敏度高的常规PCR与TaqMan实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法。

研究人员采用了几个关键技术方法：首先基于生物信息学分析筛选并验证STM1410基因在沙门菌属中的保守性与特异性；其次利用60份来自山东某孵化场的禽胚死亡临床样本（经细菌分离法确认10份阳性、50份阴性）进行方法验证；设计并优化引物与TaqMan探针体系；构建重组质粒标准品用于灵敏度与标准曲线测定；通过特异性试验、灵敏度试验、重复性试验及临床样本检测评估方法的性能。

研究结果分为多个部分。第一部分，STM1410基因在沙门菌属内高度保守。研究人员以ATCC14028菌株的STM1410基因为参考序列，对GenBank中570株沙门菌全基因组进行BLASTN比对，结果显示98.6%的菌株同源性≥95%，98.1%的菌株同源性≥98%，且在非沙门菌属数据库中无匹配序列，证明该基因可作为特异性检测靶标。第二部分，重组质粒鉴定。研究人员成功扩增STM1410目标片段并克隆至pBlueScript II KS(+)载体，测序确认无碱基突变，获得重组质粒pBlue-STM1410。第三部分，常规PCR条件优化。通过梯度退火温度与引物浓度优化，确定最佳退火温度为50℃，引物浓度为0.25μM，反应体系与循环条件得以确立。第四部分，常规PCR特异性。该方法可特异性扩增15种不同血清型沙门菌的410 bp目标条带，对其他8种常见病原菌及阴性对照均无扩增。第五部分，常规PCR灵敏度。最低检测限为5×10¹拷贝/μL。第六部分，TaqMan qPCR反应体系优化。最终确定引物浓度为0.2μM，探针浓度为0.1μM，反应条件为95℃预变性5分钟，随后40个循环（95℃10秒，60℃30秒）。第七部分，TaqMan qPCR标准曲线。标准曲线线性关系良好，方程为y=-3.379x+40.91，相关系数（R²）为0.9995，扩增效率（E%）为97.7%。第八部分，TaqMan qPCR特异性。仅15种沙门菌血清型出现特异性扩增曲线，其余病原菌及阴性对照无信号。第九部分，TaqMan qPCR灵敏度。最低检测限为5×10⁰拷贝/μL。第十部分，TaqMan qPCR重复性。组内与组间变异系数均低于3%，表明方法重复性优异。第十一部分，临床样本检测。传统分离法阳性率为16.7%（10/60），常规PCR阳性率为48.3%（29/60），TaqMan qPCR阳性率为53.3%（32/60），显示PCR方法灵敏度显著高于传统培养法。

在讨论部分，研究人员指出传统检测方法操作繁琐、耗时长且难以定量，而TaqMan qPCR相比SYBR Green法特异性更高、假阳性更少。STM1410基因克服了以往靶基因血清型覆盖不全或特异性不足的问题，在570株沙门菌中均高度保守，涵盖肠沙门菌（Salmonella enterica）各亚种及83种血清型。本研究的常规PCR灵敏度与基于cigR基因的方法相当，qPCR灵敏度接近部分同类研究水平，且在高背景样本中表现稳定。临床样本检测结果验证了方法的实际应用价值。研究人员同时指出，当前样本量有限，未来可扩大样本进一步验证。此外，数字PCR（dPCR）虽可实现绝对定量，但成本高且仍无法区分活菌与死菌，未来可结合叠氮溴化丙锭（PMA）技术开发活菌检测体系。综上所述，本研究成功建立了基于STM1410基因的常规PCR与TaqMan qPCR检测方法，特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于环境样本及临床样本的沙门菌快速检测，为沙门菌病的防控提供了可靠的技术支持。