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在近期发表于《自然》的一项研究中，研究人员首次在小鼠体内实现了稳定、T细胞位点特异性的嵌合抗原受体（CAR）转基因整合，将过去十年在T细胞受体α恒定区（TRAC）重塑、CAR信号调控及病毒载体靶向领域的进展整合于一体，单次输注即可在人源化荷瘤小鼠中生成具有治愈
在近期发表于《自然》的一项研究中，研究人员首次在小鼠体内实现了稳定、T细胞位点特异性的嵌合抗原受体（CAR）转基因整合，将过去十年在T细胞受体α恒定区（TRAC）重塑、CAR信号调控及病毒载体靶向领域的进展整合于一体，单次输注即可在人源化荷瘤小鼠中生成具有治愈效果的TRAC-CAR人T细胞。CAR-T细胞疗法已彻底改变复发难治性B细胞恶性肿瘤的治疗格局，目前已有七款产品获美国食品药品监督管理局批准。然而，现有活体药物的制备面临严峻挑战：需通过单采收集患者T细胞，运送至中心化设施，经病毒载体转导实现CAR转基因的稳定整合，至少扩增一周并进行质量控制后方可回输。从产品预约到制备完成常耗时数周，回输前需化疗清淋，且可能因不良反应需住院治疗。尽管如此，CAR-T细胞仍需求旺盛，因其可单剂治愈，这是其他治疗手段无法企及的优势。因此，亟需建立快速、低成本的CAR-T细胞制备策略，无论是进一步优化自体制备、开发同种异体细胞平台，还是实现体内原位生成。Nyberg、Bernard及其同事研发并整合了一系列技术，将体内原位生成策略的精准度提升至前所未有的水平。Eyquem团队基于基因组工程、CAR-T细胞生物学及基因治疗领域十余年的进展，针对传统CAR转基因多采用半随机整合载体递送的局限，通过将CAR转基因定点整合至TRAC基因座，实现了CAR表达水平的精准调控，获得TRAC-CAR T细胞。此类细胞基础张力信号减弱，CAR表达更优，细胞适应性增强，从而降低细胞输注剂量需求，同时借助内源性调控元件实现转录控制，无需额外连接启动子。此外，通过优化CAR信号特性也可独立降低T细胞剂量需求，例如校准型1XX CAR兼具CD28与4-1BB CAR的功能特征，靶向CD19的1XX CAR在难治性弥漫大B细胞淋巴瘤患者中展现出优异疗效与安全性，所需剂量仅为上市CAR-T细胞的1/4至1/10。降低细胞剂量为体内工程化奠定了有利基础，但如何实现仍是核心难题。此前体内CAR策略始终受限于两大相互关联的问题：一是慢病毒及脂质纳米颗粒（LNP）平台虽可系统性转导T细胞，但分别导致随机基因组整合或瞬时游离表达，既无法实现TRAC基因座整合的优势，也无法保障持久CAR表达；二是难以在体内特异性靶向T细胞，易引发非靶组织插入突变风险（包括生殖系），尤其需警惕肿瘤细胞的异位CAR表达，这可能导致抗原阴性逃逸克隆产生。Nyberg等人通过双载体平台攻克上述瓶颈。首个组分是融合型慢病毒衍生颗粒——包膜递送载体（EDV），通过CD3靶向将Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物与TRAC靶向向导RNA（gRNA）递送至T细胞，该载体仅提供瞬时核酸酶活性且无基因组 cargo，最大限度降低脱靶编辑风险。第二个组分是通过结构导向衣壳工程进化获得的腺相关病毒（AAV）变体，通过结合CD7增强T细胞嗜性（CD7为T/NK细胞表面受体），减少非淋巴组织供体DNA递送。该AAV载体携带无启动子的CAR转基因，两侧为TRAC基因座特异性同源臂。多重冗余筛选机制确保CAR仅在T细胞中表达：CD7与CD3共靶向、共感染需求、无启动子供体DNA及位点特异性整合依赖的转录激活。在人源化小鼠模型中，单次系统性给予该双载体系统即可生成TRAC-1XX CAR T细胞，扩增后可达CD45+细胞的~40%。研究采用缺乏MHC I/II的免疫缺陷小鼠以降低异种反应性介导的T细胞活化，多数治疗组小鼠在三周内完全清除侵袭性CD19+白血病。该策略在多发性骨髓瘤（靶向BCMA）与肉瘤（靶向B7-H3）小鼠模型中也取得成功。体内生成的TRAC-1XX CAR T细胞富集于CD45RA+CD62L+CD8+T细胞亚群，提示处于初始或干细胞样记忆状态，且CAR表达稳健。研究人员认为这归因于原位编辑保留了初始T细胞生物学特性，规避了体外制备中的活化与扩增应激，并与1XX CAR的作用相协同。尽管该技术仍需解决若干开放性问题——包括EDV与AAV组分在免疫健全人群中的免疫原性、静息初始T细胞在无淋巴清除条件下的同源定向修复（HDR）效率、疾病扰动免疫微环境中可实现的靶向编辑率，以及治疗剂量下系统性CRISPR递送的安全性特征，且人源化小鼠模型的预测价值仍需验证，但其概念突破意义重大。体内TRAC靶向1XX CAR递送有望大幅缩短自体CAR-T制备周期，免除清淋化疗需求，若定价合理，将极大拓展潜在治愈性细胞疗法的可及性。
研究背景与意义
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已重塑复发难治性B细胞恶性肿瘤的治疗范式，目前已有七款产品获美国食品药品监督管理局批准。然而，现有自体CAR-T制备流程高度复杂：需单采患者T细胞，经集中式病毒转导、体外扩增及质控后回输，全程耗时数周，且需预处理化疗并防范严重不良反应，极大限制了治疗可及性。尽管工艺持续优化，但体内原位生成策略因长期受限于非特异性整合与脱靶风险未能突破。在此背景下，Nyberg、Bernard及Eyquem团队整合基因组工程、CAR信号生物学及载体设计领域十余年进展，在《Cell Research》发表研究，首次实现小鼠体内稳定、T细胞位点特异性的TRAC基因座CAR整合，为简化制备流程、提升安全性提供了全新路径。
关键技术与样本来源
研究采用双载体递送系统：①包膜递送载体（EDV）——CD3靶向的慢病毒衍生颗粒，递送Cas9核糖核蛋白（RNP）与TRAC靶向向导RNA（gRNA），仅提供瞬时编辑活性；②工程化腺相关病毒（AAV）——通过结构导向衣壳改造获得CD7高亲和力变体，递送无启动子CAR转基因盒（两端含TRAC同源臂）。研究使用MHC I/II缺陷NSG人源化小鼠模型，分别构建CD19+白血病、BCMA+多发性骨髓瘤及B7-H3+肉瘤模型评估疗效。
研究结果
1. 双载体系统的设计与靶向机制
EDV通过CD3介导T细胞特异性递送Cas9 RNP，避免基因组整合风险；AAV通过CD7增强T细胞嗜性，二者协同实现TRAC位点特异性编辑。多重保障机制（共靶向、共感染需求、无启动子设计、整合依赖转录）严格限制CAR仅在T细胞表达。
2. 体内TRAC-CAR T细胞的生成与抗肿瘤功效
单次静脉注射双载体后，人源化小鼠体内TRAC-1XX CAR T细胞扩增显著，占比达CD45+细胞的~40%。在CD19+白血病模型中，三周内多数小鼠实现肿瘤完全清除；该策略在多发性骨髓瘤（靶向BCMA）与肉瘤（靶向B7-H3）模型中也证实有效。
3. 细胞表型与功能特征
体内编辑生成的TRAC-1XX CAR T细胞富集于CD45RA+CD62L+CD8+亚群，呈现初始或干细胞样记忆状态，CAR表达均匀且持续。研究人员认为此表型源于原位编辑规避了体外活化和扩增应激，与1XX CAR的信号校准特性协同作用。
讨论与结论
研究证实，体内TRAC靶向整合策略可生成兼具高效抗肿瘤活性与良好安全特征的CAR-T细胞，突破了传统制备的时空限制。尽管仍需验证免疫原性、静息T细胞编辑效率及临床转化安全性，但该技术有望大幅缩短制备周期、免除清淋化疗，显著提升细胞疗法的可及性。研究人员强调，这一成果标志着体内细胞工程化从概念走向精准可控的重要里程碑。
