可编程的Fc编码DNA瓦片-立方体捕获技术通过PAM工程设计的锚定开关和CRISPR/Cas12a切割机制，实现了基于凝血酶激活的比率型ECL/SERS生物传感器

《Analytica Chimica Acta》：Programmable Fc-Encoded DNA Tile–Cube Capture Enables a Thrombin-Activated Ratiometric ECL/SERS Biosensor via a PAM-Engineered Toehold Switch and CRISPR/Cas12a Cleavage

钱静|卢静芬|陈旭|沈浩|卢菲菲

中国苏州苏州大学第九人民医院临床实验室医学系

摘要

背景

准确的凝血酶检测对于凝血相关评估非常重要，但在超低水平下进行可靠定量仍然具有挑战性，因为基质干扰、电极间差异以及单通道信号漂移可能会影响分析准确性。在此，我们开发了一种凝血酶响应的比率电化学发光/表面增强拉曼散射（ECL/SERS）生物传感器，该传感器结合了Fc编码的DNA瓦片、DNA立方体捕获支架以及PAM工程化的趾扣开关调控的CRISPR/Cas12a模块，所有这些组件都安装在Ti₃C₂/CsPbBr₃@PDA@Au修饰的电极上。

结果

一种可故意切割的连接探针（LP）作为桥梁，将富含Fc的DNA瓦片保持在电极附近。在没有凝血酶的情况下，完整的LP能够实现瓦片的捕获，导致ECL信号减弱和强烈的Fc SERS信号。当有凝血酶存在时，分裂的适配体接近组装会激活趾扣开关和Cas12a/crRNA，从而导致LP切割、Fc瓦片耗尽、ECL信号恢复和SERS信号减弱。这两个相互关联的信号被整合为Q = I_ECL/I_SERS。该生物传感器的检测范围为1 × 10^-7至1 × 10^-1 nM，检测限约为0.064 fM。合成的切割LP标准品证实LP切割可以直接转化为比率ECL/SERS切换。血清加标回收测试的回收率为96.8%–104.0%。

意义

这项工作建立了一种可编程的捕获-释放策略，将凝血酶识别转化为CRISPR/Cas12a介导的LP切割和确定的界面重构，为蛋白质生物传感提供了一个灵敏、内部参考且可扩展的平台。

引言

凝血酶是一种在凝血、血栓形成和炎症过程中起关键作用的丝氨酸蛋白酶。异常的凝血酶活性与血栓性疾病、心血管事件、围手术期并发症和弥散性血管内凝血有关，使其成为止血评估和治疗监测的临床相关生物标志物。[1], [2], [3] 然而，准确的凝血酶定量仍然具有挑战性，因为目标浓度可能很低，生物基质复杂（例如血浆/血清、全血、含抗凝剂的样本），并且非特异性吸附或背景波动可能会掩盖真实信号。因此，对于在真实样本中具有超灵敏度、选择性和定量可靠性的生物传感器仍有持续的需求。[4], [5], [6]

电化学发光（ECL）传感因其低背景、高信噪比以及与紧凑型电化学设备的兼容性而适用于凝血酶检测。[7], [8], [9], [10] 表面增强拉曼散射（SERS）在报告分子位于等离子体热点时提供了正交的读数方式，并具有分子指纹特异性和高灵敏度。[9], [11], [12], [13], [14], [15] 然而，单一模式的测量通常受到定量稳健性的限制：ECL信号可能会因电极变化、荧光团负载和表面污染而漂移，而SERS则受热点分布、聚焦和底物异质性的影响。比率双模式传感——特别是具有相互关联信号的情况下——通过内部标准化共同的变异来源，提供了一种提高稳健性的实用方法。[13], [16], [17]

除了换能器工程外，核酸编程还实现了可控的识别到信号的转换。基于适配体的凝血酶传感器可以触发链位移或接近诱导的组装，而CRISPR核酸酶则通过旁路切割实现强大的放大作用。一个关键挑战是将蛋白质目标转化为具有高特异性和低泄漏的核酸激活剂。分裂适配体策略通过要求目标结合来组装功能性触发器来帮助解决这一问题，但如果没有严格的门控机制，仍可能发生非预期的背景组装。界面架构同样重要，因为识别和放大与电极的耦合方式往往决定了最终的分析性能。[18], [19], [20], [21] DNA纳米结构提供了刚性且可寻址的界面；特别是线框DNA多面体（例如DNA立方体）提供了距离控制，这对于ECL信号减弱和SERS热点定位非常有价值，而DNA瓦片则提供了模块化、高负载的报告分子构建块，具有可预测的几何形状。

最近的双模式ECL/SERS生物传感器通过结合ECL的低背景定量能力和SERS的分子指纹识别及热点增强灵敏度，在提高分析可靠性方面显示出了明显优势。例如，已经报道了用于NF-kB p50检测的立方体轨道编码ECL/SERS平台，其中目标触发的核酸级联反应调节DNA纳米结构界面上的Fc耗尽，从而实现ECL信号恢复和SERS信号减弱[22]。类似地，基于CsPbBr₃@COF-LZU1@Au的PER/CRISPR-Cas12a系统和基于CsPbBr₃@PDA@Au的T7–CRISPR/Cas13a系统用于miR-21和BNP的检测，证明了相互关联的ECL/SERS输出可以减少信号漂移、电极间差异和基质干扰。[9], [23] 然而，这些报道的策略主要依赖于直接切割、位移或从电极表面剥离预固定的报告分子探针。开发一种可编程的界面，在这种界面中，目标触发的核酸酶活性调节报告分子的保留而不是直接去除报告分子，将为稳健的双模式生物传感提供新的途径。

在这里，我们提出了一种双模式ECL/SERS凝血酶生物传感器，该传感器结合了Fc修饰的DNA瓦片、凝血酶触发的接近组装（通过PAM工程化的趾扣开关激活CRISPR–Cas12a）以及安装在Ti₃C₂/CsPbBr₃@PDA@Au纳米复合电极上的DNA立方体捕获界面。钙钛矿层（CsPbBr₃）作为阳极ECL发射器，PDA增强了界面稳定性，Au纳米颗粒生成等离子体热点并提供Au–S位点用于DNA固定，而Ti₃C₂ MXene支持高效的电荷传输。传感机制通过一个可切割的连接探针（LP）来控制界面“捕获或释放”门。在没有凝血酶的情况下，完整的LP桥接立方体捕获域和Fc瓦片对接区域，将富含Fc的瓦片保持在电极附近以抑制ECL（接近效应减弱/阻断）并增强Fc SERS。当凝血酶结合时，分裂的适配体共定位会触发趾扣开关并暴露PAM兼容的双链结构以激活Cas12a。激活的Cas12a切割LP，防止瓦片保留并从近表面区域耗尽Fc，从而恢复ECL信号并减弱SERS信号。定量分析使用比率信号$$' role="presentation">$$，从而通过减轻共模变化来提高精度。

章节片段

设计和工作原理

图1展示了所提出的比率ECL/SERS生物传感器的构建和工作原理。该传感策略结合了Ti₃C₂/CsPbBr₃@PDA@Au换能器、DNA立方体/线框支架、Fc编码的DNA瓦片以及凝血酶触发的TS/Cas12a介导的LP切割模块。核心概念是调节富含Fc的DNA瓦片在电极表面的保留或耗尽。

结论

在这项研究中，我们通过在Ti₃C₂/CsPbBr₃@PDA@Au（PAM）双功能电极上集成Fc编码的DNA瓦片、DNA立方体捕获支架和PAM工程化的趾扣开关调控的CRISPR/Cas12a模块，开发了一种凝血酶激活的比率ECL/SERS生物传感器。核心机制是一个界面“捕获或释放”门：一种可故意切割的连接探针（LP）作为唯一将富含Fc的瓦片保持在电极附近的桥梁。在没有凝血酶的情况下，LP保持完整，

CRediT作者贡献声明

钱静：正式分析、数据管理。卢菲菲：撰写 – 审稿与编辑、监督、研究、概念化。沈浩：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理。陈旭：撰写 – 初稿、软件。卢静芬：软件、数据管理

利益冲突

所有作者均未披露任何可能影响本文工作的相关关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

5. 致谢

本工作得到了中国家族性高胆固醇血症（FH）筛查和诊断标准研究（2021YFC2500602）、关于血流紊乱诱导的内皮细胞DKK2促进的动脉粥样硬化斑块形成机制和转化的实验研究（82470483），以及家族性高胆固醇血症致病基因位点筛查（YK202522）的支持。