APOE介导的巨噬细胞免疫代谢重编程驱动透明细胞肾细胞癌中脂质递送至肿瘤细胞——一个代谢检查点(metabolic checkpoint)

《Cancer Letters》：APOE-mediated immunometabolic reprogramming of macrophages drives lipid delivery to tumor cells in clear-cell renal cell carcinoma — a metabolic checkpoint

摘要：透明细胞肾细胞癌（clear-cell renal cell carcinoma, ccRCC）的特征是胞质富含脂质的肿瘤细胞在组织中呈"透明"表现；然而这些脂质的来源及其在肿瘤进展中的作用尚不清楚。值得注意的是，培养的ccRCC细胞在体外（in vitro）极少呈现透明细胞表型，提示ccRCC中的脂质积聚并非细胞自主性的。本研究表明，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）经历免疫代谢重编程，并成为ccRCC细胞脂质的主要供应者。VHL（von Hippel-Lindau）基因缺陷的肾小管上皮细胞激活TAMs后，后者获得脂肪生成和胆固醇代谢特征，通过TGF-β（transforming growth factor-β）-APOE依赖途径积累脂质并分化为脂质负载巨噬细胞（lipid-laden macrophages, LLMs）。LLMs随后通过隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）将脂质直接转移至肿瘤细胞。脂质组学分析显示LLMs与受体肿瘤细胞具有几乎一致的脂质谱，富含胆固醇和磷脂酸（phosphatidates）但不含甘油三酯。在患者队列中，巨噬细胞中APOE高表达与晚期疾病分期相关。体内（in vivo）实验中，敲除巨噬细胞特异性Apoe可消除透明细胞表型、减少原位及异位移植ccRCC模型中的肿瘤生长并抑制转移。这些发现揭示了一种此前未被认识的巨噬细胞-肿瘤互作模式：重编程的TAMs向肿瘤细胞供给脂质，驱动透明细胞表型形成及疾病进展。靶向TGF-β-APOE轴或TNT介导的脂质转移是潜在治疗策略。更广泛而言，本研究支持"代谢检查点（metabolic checkpoint）"范式，揭示了ccRCC中一个可被干预的治疗弱点。

论文解读：APOE介导的巨噬细胞免疫代谢重编程驱动透明细胞肾细胞癌中脂质递送至肿瘤细胞——一个代谢检查点

透明细胞肾细胞癌（clear-cell renal cell carcinoma, ccRCC）是最常见的肾细胞癌亚型，其特征为肿瘤细胞胞质充满脂质而呈现"透明"组织学表现，约80%病例由VHL（von Hippel-Lindau）抑癌基因缺失驱动。VHL缺失导致HIF（hypoxia-inducible factor）稳定及代谢重编程，既往认为ccRCC细胞可通过逆三羧酸循环（reverse TCA cycle）促进自身脂质合成，但培养的ccRCC细胞在体外极少出现透明细胞表型，提示脂质积聚可能依赖肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。已有研究提示ccRCC细胞可通过清道夫受体B1（scavenger receptor B1, SCARB1）摄取高密度脂蛋白（high-density lipoprotein, HDL）来源脂质，但无法完全解释体外透明细胞表型缺失现象。因此，研究人员假设TME中的免疫细胞——尤其是肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）——可能参与脂质供给。本文由Thi-Ngoc Nguyen等人完成，发表于《Cancer Letters》，揭示了VHL缺陷肾小管上皮细胞重编程TAMs为脂质负载巨噬细胞（lipid-laden macrophages, LLMs），后者经TGF-β（transforming growth factor-β）-APOE轴分化并通过隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）向ccRCC细胞直接转移脂质，驱动透明细胞表型形成及肿瘤进展，提出靶向此"代谢检查点（metabolic checkpoint）"的治疗新思路。

主要关键技术方法：

研究人员采用VHL敲低（VHL knockdown, VHL^KD）人肾近曲小管上皮细胞系HK-2与THP-1来源或原代CD14⁺外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）来源巨噬细胞（MΦs）的Transwell共培养及两步直接共培养体系，结合荧光标记胆固醇酯、BODIPY染色及活细胞时间序列成像观察TNT介导的脂质转移；通过流式分选ApoE^hi与ApoE^lo巨噬细胞进行bulk RNA测序（RNA-Seq）；利用液相色谱-质谱（mass spectrometry, MS）进行脂质组学分析；采用CIBERSORTx结合单细胞RNA测序（single-cell RNA-Seq, scRNA-Seq，GSE242299）对TCGA-KIRC（The Cancer Genome Atlas–Kidney Renal Clear Cell Carcinoma）队列进行巨噬细胞特异性APOE表达去卷积及临床相关性分析；使用Hoxb7-Cre-GFP; Vhlh^loxP/loxP小鼠（Vhlh为小鼠VHL同源基因）原位癌模型及NOD/SCID小鼠肾包膜下786-O细胞（含荧光素酶标记786-O^Luc）原位异种移植模型，经氯膦酸盐脂质体（clodronate-containing liposomes）清除内源性巨噬细胞后回输ApoE敲低（knockdown, KD）、ApoE过表达（overexpression, OV）或CDC42（cell division cycle 42）敲低THP-1/小鼠巨噬细胞，评估肿瘤生长、透明细胞形成及肺转移；临床样本取自台湾大学医院及Biomax组织芯片进行免疫荧光/免疫组化验证。

研究结果：

3.1. VHL-deficient kidney tubule cells induce metabolic reprogramming of MΦs in ccRCC

研究人员比对HK-2^VHLKD激活巨噬细胞与HK-2^WT对照巨噬细胞的转录组（GSE183976）及人ccRCC与正常邻近组织（normal adjacent tissue, NAT）来源TAMs的scRNA-Seq数据（GSE242299），发现2015个重叠差异基因显著富集脂肪生成（adipogenesis）、胆固醇稳态及髓系分化相关通路；其中APOE上调最为显著（人ccRCC TAMs中log₂FC=380）。表明VHL缺陷肾小管细胞诱导TAMs向脂质生成表型重编程。

3.2. VHL-deficient cells induce lipid-laden MΦ (LLM) formation

HK-2^VHLKD共培养巨噬细胞较HK-2^WT共培养组显著摄取更多DiI标记氧化低密度脂蛋白（DiI-oxLDL）并在完全培养基中自发积累胞内脂质（Oil Red O阳性）。人ccRCC组织及Vhlh^KO小鼠肾脏中CD68⁺/F4/80⁺巨噬细胞BODIPY阳性比例高于NAT/野生型，且随肿瘤级别升高增加，证实体内存在LLMs。

3.3. Direct lipid transfer from MΦs to VHL-deficient kidney tubular cells via TNTs

两步共培养显示BODIPY-胆固醇酯预负载的活化巨噬细胞（MΦ^Act）可向HK-2^VHLKD而非HK-2^WT转移脂质；活细胞成像捕捉到脂质囊泡沿细长、悬浮于基底面的肌动蛋白（F-actin）阳性细胞突起——即TNTs——定向转运入受体细胞。小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）标记确认TNTs起源于LLMs。脂质组学显示MΦ^Act及与MΦ^Act共培养的HK-2^VHLKD共享富集胆固醇酯和磷脂酸（phosphatidates）的脂质谱，区别于对照组。人ccRCC组织及Vhlh^KO小鼠肾脏冰冻切片中亦观察到TAMs伸向肿瘤细胞的TNT样结构（phalloidin阳性）。Transwell分隔实验排除外泌体（exosome）及细胞融合/吞噬机制，确认TNT直接转移。

3.4. APOE is a marker for tumor-associated LLMs with clinical relevance

人ccRCC及Vhlh^KO小鼠肾脏中APOE⁺巨噬细胞主要位于瘤旁及瘤内，NAT罕见；TCGA-KIRC队列CIBERSORTx去卷积显示巨噬细胞特异性APOE高表达独立关联晚期病理分期及高级别（多元线性回归校正年龄性别）。分选HK-2^VHLKD激活巨噬细胞的ApoE^hi与ApoE^lo亚群进行RNA-Seq，ApoE^hi富集Hallmark脂肪生成与胆固醇稳态基因集，ApoE^lo富集炎症反应与蛋白分泌基因集，提示TAM功能异质性。

3.5. APOE^hiMΦ cell fate is induced by TGF-β signaling

IPA（Ingenuity Pathway Analysis）上游调控分析预测TGF-β1为ApoE^hi巨噬细胞最强调控因子。qRT-PCR显示ApoE^hi巨噬细胞TGFβR1/TGFβR2上调而ApoE^lo巨噬细胞TGF-β上调，提示ApoE^lo旁分泌TGF-β诱导姐妹细胞向ApoE^hi分化；人ccRCC中CD68⁺APOE⁺TGFβR1⁺/TGFβR2⁺细胞增多。中和抗TGF-β抗体剂量依赖性降低HK-2^VHLKD诱导的ApoE^hi比例；HK-2^VHLKD共培养巨噬细胞磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）水平升高，证实TGF-β-Smad信号驱动APOE^hiLLM命运决定。

3.6. APOE⁺MΦs enhance the clear-cell and hyperplastic phenotypes in Vhlh^KOkidney

Vhlh^KO小鼠经氯膦酸盐脂质体清除内源性巨噬细胞后回输小鼠ApoE^KD、ApoE^OV或对照（Scr）巨噬细胞。野生型肾脏表型不受影响；Vhlh^KO肾脏中回输ApoE^OV巨噬细胞增加透明细胞簇及腺样上皮堆积（腺瘤），回输ApoE^KD则减少；BODIPY⁺F4/80⁺LLM比例及Ki67⁺增殖指数与巨噬细胞ApoE水平正相关，证明巨噬细胞APOE功能对透明细胞形成及上皮增生至关重要。

3.7. Interference with LLM or TNT formation in vivo inhibits tumor growth and metastasis

筛选发现CDC42抑制剂ML-141最有效阻断MΦ^Act与HK-2^VHLKD间TNT形成。NOD/SCID小鼠肾包膜下注射786-O^Luc联合对照、APOE^KD或CDC42^KDTHP-1细胞（经氯膦酸盐预处理），每周回输相应THP-1。单独786-O生长慢且不形成透明细胞表型；加对照THP-1促生长并形成典型透明细胞肿瘤；APOE^KD或CDC42^KDTHP-1显著降低肿瘤体积、透明细胞数目、瘤细胞内BODIPY⁺脂质及肺转移灶数，Ki67增殖下降。APOE^KD减少LLM形成但不影响TAM招募及血管生成，CDC42^KD不影响LLM形成但阻断TNT介导脂质转移，二者均不影响TAM招募，说明APOE负责LLM脂质积聚，CDC42负责TNT形成与跨细胞脂质传递。

讨论与结论：

本研究阐明ccRCC中VHL缺陷肾小管上皮细胞通过旁分泌激活TAMs，后者在TGF-β诱导下分化为APOE^hi脂质负载巨噬细胞（LLMs），LLMs经肌动蛋白为基础的隧道纳米管（TNTs）将胆固醇酯和磷脂酸等脂质直接转移至VHL缺失的肿瘤细胞，使其获得特征性透明细胞表型并促进增殖与转移。巨噬细胞特异性APOE高表达与ccRCC患者不良预后相关。敲除巨噬细胞ApoE或抑制TNT形成（如CDC42抑制）可消除透明细胞表型、抑制原位肿瘤生长及肺转移。TAMs进一步分为产脂APOE^hi亚群（脂质供给）与APOE^lo炎症亚群（可能通过TGF-β旁分泌调控APOE^hi分化）。该TGF-β–APOE–TNT脂质转移轴构成ccRCC中一个可被靶向的代谢检查点（metabolic checkpoint），为克服现有免疫检查点阻断耐药提供新方向。靶向APOE通路或TNT介导的脂质转移有望选择性干扰肿瘤代谢适应而不完全废除巨噬细胞固有免疫功能。