《Frontiers in Genome Editing》：CRISPR and Fanzor in sickle cell disease: current progress and future prospects
基因组编辑技术的进步为包括镰状细胞病（SCD）在内的多种遗传性疾病的治疗开辟了新前沿。SCD是最常见的单基因血液疾病，可导致剧烈疼痛、器官损伤及预期寿命缩短。近期，基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9的基因疗法获得临床批准用于治疗重型镰状细胞贫血，这是遗传疾病治疗领域的重要里程碑。尽管取得突破，CRISPR技术仍存在局限，需要进一步创新。替代性方法如Fanzor（Fz）系统正在开发，以补充CRISPR的能力。与通常编码于原核生物中的CRISPR不同，Fz编码于真核生物基因组中，提供了一种适用于所有生命界的通用RNA引导机制。Fz的真核起源可能促进其在多种细胞类型和组织中更高效递送，增强其治疗潜力。研究人员在此综述了CRISPR技术在编辑SCD相关突变方面的当前成功与局限，同时探讨了Fz作为SCD基因组编辑工具的潜在作用——该领域尚未见其应用研究。
1 引言
镰状细胞病（SCD）是由β-珠蛋白基因（HBB）第六密码子的单点突变引起的遗传性疾病，导致异常血红蛋白（HbS）产生。HbS使柔韧的红细胞转变为僵硬的镰刀状细胞，阻塞血流并引发疼痛与器官损伤。全球每年约51.5万新生儿患SCD，75%以上病例发生在非洲；若无适当医疗，近30%未接受治疗的非洲SCD患儿在5岁前死亡。现有支持治疗、羟基脲与输血虽改善预后，但仅为姑息性，无法纠正根本遗传缺陷。异体造血干细胞移植（HSCT）可治愈，但受限于供体可用性、移植相关风险及移植物抗宿主病。这些局限凸显了对根治性基因治疗策略的迫切需求。
基因组编辑技术通过精准修饰致病遗传变异，成为治疗SCD等单基因疾病的变革性手段。自1970年代基因工程诞生以来，DNA与RNA操作能力彻底改变了生物医学研究与治疗开发。现代基因组编辑工具旨在实现高效、位点特异性的遗传修饰，并最小化脱靶效应，尤其在造血干细胞的临床应用中。CRISPR-Cas系统的发现推动了该领域的快速发展，已成为农业、生物技术与医学中的强效工具，近期更获批用于SCD与输血依赖型β-地中海贫血的治疗，标志着精准医学的里程碑。
靶向基因组编辑依赖可编程核酸酶在特定位点引入DNA损伤，激活内源性修复途径，如非同源末端连接（NHEJ）与同源定向修复（HDR）。针对SCD的策略包括纠正致病HBB突变、破坏调控元件以诱导胎儿血红蛋白表达，或修饰珠蛋白基因调控以减轻疾病严重程度。当前研究更关注提高编辑精度、降低基因毒性及增强临床转化的可扩展性。
2021年发现的OMEGA（Obligate Mobile Element-guided Activity）系统与2023年鉴定的Fanzor（Fz）系统进一步扩展了基因组编辑工具箱。Fz是一类真核生物CRISPR-Cas样内切核酸酶，天然存在于真核细胞且体积更小（约400–700个氨基酸），在递送效率与细胞内稳定性上具有优势。机制上，Fz可在特定基因组位点产生双链DNA断裂（DSBs）或交错切口，触发哺乳动物细胞的内源性修复过程。其紧凑的体积尤其适合包装入腺相关病毒（AAVs）等常用病毒递送系统，这对SCD中骨髓来源造血干细胞的高效编辑至关重要——相比之下，CRISPR相关核酸酶如Cas9通常超过1300个氨基酸，给递送效率与载体设计带来挑战。此外，Fz的真核起源可能使其与细胞内源DNA修复途径（同源重组HR与非同源末端连接NHEJ）更兼容，有望提高β-珠蛋白基因校正精度与效率。
2 镰状细胞病（SCD）
SCD由β-珠蛋白基因的单个碱基对突变引起，即腺嘌呤（A）被胸腺嘧啶（T）替换，导致β-珠蛋白链第六位的亲水谷氨酸（GAG）被疏水缬氨酸（GTG）取代。该突变在缺氧条件下驱动HbS聚合，引发红细胞变形、溶血与血管闭塞并发症。临床表现包括剧痛危象、慢性贫血、黄疸、卒中及对感染的易感性增加，毛细血管阻塞可导致危及生命的事件并显著影响患者生活质量。值得注意的是，SCD的临床进程个体差异极大，部分患者症状轻微，另一些则频繁出现严重并发症，但其可变性的分子机制仍不明确，目前尚无可靠的基因型或临床预测因子，也无经验证的体外生物标志物可用于预后判断或风险分层。
从基因组编辑视角看，SCD的分子与临床特征定义了多个合理的CRISPR干预靶点：直接纠正致病HBB变异，或在HBB/HBG位点重建良性β-地中海贫血或遗传性胎儿血红蛋白持续存在（HPFH）等位基因，从源头阻止HbS聚合；或破坏BCL11A及其红系特异性增强子、编辑HBG启动子及其他胎儿血红蛋白调控因子，重新激活γ-珠蛋白表达以提高胎儿血红蛋白水平，抑制HbS聚合并减少血管闭塞。其他候选靶点还包括参与红细胞水化、黏附与炎症的基因，可调节下游并发症。尽管仍处于临床前开发阶段，Fz介导的基因组编辑策略预计将遵循与CRISPR相同的靶点类别，同时在特定临床场景中可能在递送与免疫原性上具有优势。
3 孕妇与新生儿的镰状细胞病（SCD）诊断方法
SCD可通过血液学、生化与分子技术在所有年龄段诊断。初始评估包括全血细胞计数（CBC）、外周血涂片检查与网织红细胞计数，可提示溶血性贫血与特征性红细胞形态异常。确诊需通过血红蛋白电泳、高效液相色谱（HPLC）与等电聚焦等血红蛋白分析方法，准确识别与定量血红蛋白变异体（如HbS）。若结果不确定，则采用针对HBB基因突变的分子诊断方法。这些诊断方法对基因组编辑疗法具有重要临床意义：准确的诊断与早期基因分型对患者选择、风险分层与治疗时机至关重要。
妊娠期建议尽早进行携带者筛查与胎儿诊断检测，以确定高风险夫妇并在必要时判断胎儿是否受累。若母亲为携带者，父亲也应接受检测；若双方均为携带者，胎儿患SCD的概率为25%。高风险情况下可进行绒毛膜取样（CVS，孕11–14周）或羊膜穿刺术（孕15–18周）以确诊。这些产前策略支持早期风险评估、靶向遗传咨询与知情生育决策，也为未来宫内或极早期基因组编辑干预提供了框架。
许多国家常规开展新生儿SCD筛查，出生后通过足跟采血进行检测，常用技术包括血红蛋白电泳、薄层等电聚焦或HPLC。若初筛异常，则进行确诊性血液检测。早期识别SCD有助于长期治疗规划，这对CRISPR与Fz等根治性基因组编辑策略的临床转化尤为重要。
4 镰状细胞病（SCD）的治疗：基因组编辑疗法的背景
SCD的传统管理聚焦于症状控制、并发症预防及降低发病率与死亡率，包括药物治疗、输血计划与预防感染等措施，但这些方法需终身治疗且无法根治，推动了直接靶向分子病因的基因治疗策略发展。历史上，唯一的根治性方法是异体HSCT，通过供体干细胞替换患者缺陷的造血系统，但受限于供体短缺、移植相关毒性、移植物抗宿主病及严格的适应证。
近年来，自体造血干细胞的体外基因组编辑彻底改变了SCD治疗格局。CRISPR-Cas9策略已获临床批准，通过编辑患者来源的细胞，要么纠正致病HBB突变，要么通过破坏BCL11A等调控元件重新激活胎儿血红蛋白表达，消除了对匹配供体的需求并大幅降低了异体移植的免疫风险。除CRISPR外，Fz等新兴平台提供了额外治疗潜力：其紧凑体积与真核起源可能在递送效率与细胞兼容性上具有优势，成为下一代SCD基因疗法的有力候选。基因组编辑技术代表了SCD管理的范式转变——从终身对症治疗转向根治性干预。
4.1 根治性治疗
4.1.1 基因治疗
Casgevy（exagamglogene autotemcel，exa-cel）是利用CRISPR技术编辑患者自身干细胞，使其产生健康非镰变红细胞的疗法，2023年获美国、英国、欧盟等多国批准用于12岁以上复发性血管闭塞危象的SCD与输血依赖型β-地中海贫血患者。其作用机制为提取患者外周血干细胞，通过编辑BCL11A红系增强子上调胎儿血红蛋白表达，编辑后的细胞回输患者体内，因源于自体而显著降低免疫排斥风险。临床试验显示多数患者摆脱剧痛危象，β-地中海贫血患者实现长期脱离输血。但治疗伴随血小板减少、白细胞减少、口腔溃疡、恶心等副作用，需持续监测长期安全性。
另一获批疗法Lyfgenia（lovotibeglogene autotemcel，lovo-cel）采用慢病毒载体修饰患者造血干细胞，使其表达抗镰变的血红蛋白T87Q。患者经清髓性预处理后单次回输编辑细胞，多数在6–18个月内显示功能性治愈迹象。常见副作用包括口腔炎、血细胞减少与发热性中性粒细胞减少症（主要源于化疗），且因潜在白血病风险带有FDA黑框警告，需严格医疗监护与长期随访。
尽管两种疗法取得突破，其全球可及性仍严重受限。SCD负担最高的撒哈拉以南非洲、中东与印度医疗资源有限，单例患者治疗成本超200万美元，且需要干细胞采集、体外编辑、清髓预处理与专科护理等高端基础设施，目前仅高收入国家的少数中心可提供。
4.2 症状管理
4.2.1 药物
羟基脲是最成熟的疾病修饰药物，通过诱导胎儿血红蛋白减少血管闭塞危象与输血需求，但需定期监测剂量依赖性血细胞减少与感染风险。L-谷氨酰胺通过改善红细胞氧化还原平衡减轻氧化应激，降低疼痛危象频率；P-选择素抑制剂crizanlizumab通过限制镰变细胞与内皮黏附减少血管闭塞。这些药物虽提供症状与疾病修饰获益，但无法消除根本遗传缺陷，凸显了基因治疗等根治性策略的必要性。
4.2.2 输血
间歇或慢性输血用于纠正贫血并降低卒中风险（尤其是经颅多普勒异常的儿童），但长期使用可能导致铁过载与同种免疫，需螯合治疗与严密监测。
4.2.3 疼痛管理
疼痛（尤其是血管闭塞危象VOC）是SCD最常见且致残的并发症，也是急诊与住院的主要原因。急性VOC疼痛采用阶梯式镇痛（从非阿片类到弱阿片类再到强阿片类），慢性疼痛则需结合药物、物理与心理干预的多模式策略。这些方法虽改善生活质量，但仍为支持性治疗，无法阻止反复组织损伤。
4.3 预防措施
预防策略旨在降低感染、卒中与器官损伤风险，是综合SCD护理的基石。包括适龄疫苗接种与预防性抗生素以降低肺炎、脑膜炎等严重细菌感染风险，以及儿童期经颅多普勒超声早期筛查卒中并对高风险者定期输血。这些措施显著提高了生存率，但需终身实施，进一步推动了对减少支持治疗依赖的根治性疗法的需求。
4.4 治疗创新
便携式诊断工具（如图像处理技术区分正常与镰变红细胞）为快速低成本筛查提供了可能。临床试验持续探索新药与疗法以改善预后。尽管症状管理仍是大多数患者的核心，基因治疗与干细胞移植的进步为根治带来了希望。未来需提高疗法可及性并扩大治疗选择，以在全球范围内改变SCD的护理模式。
5 靶向基因改变：进展与挑战
靶向基因改变通过同源重组（HR）实现基因添加、替换或失活。HR是高度保守的机制，利用完整同源DNA序列作为修复模板，参与双链断裂（DSBs）修复、复制叉救援等关键过程以维持基因组稳定性。同源定向修复（HDR）是HR的亚型，可依赖外源供体模板实现精准基因校正或插入。CRISPR-Cas系统等可编程核酸酶可在特定位点诱导DSBs，使HDR可利用模拟侧翼序列的外源供体模板进行精准编辑，将HDR从罕见随机事件转变为广泛适用的哺乳动物细胞基因修饰策略。
非同源末端连接（NHEJ）则易产生错误，常在断裂位点引入插入或缺失（indels），导致基因破坏或沉默。NHEJ无需供体模板且贯穿整个细胞周期（HDR仅限S与G2期），可用于稳定细胞系中生成功能缺失突变以实现永久基因沉默。
近期研究通过小分子与细胞周期调控将HDR效率提高数倍，并优化CRISPR平台与递送载体以增强靶向活性并降低基因毒性。但脱靶效应、HDR效率有限与递送障碍仍制约精准基因组编辑，且基因组操作的长期安全性与伦理影响需在广泛临床应用前仔细评估。
6 基因组编辑技术：可编程核酸酶
6.1 CRISPR
CRISPR是原核生物的适应性免疫系统，防御噬菌体与质粒等外来遗传物质插入。CRISPR/Cas系统分为两类：I类（I、III、IV型）含多亚基Cas蛋白复合物，II类（II、V、VI型）使用单一Cas蛋白。其中II型CRISPR/Cas9因结构简单被广泛用于基因工程。
CRISPR/Cas9系统由向导RNA（gRNA）与Cas9蛋白组成。最常用的SpCas9源自化脓链球菌，含1368个氨基酸，作为大型多结构域DNA内切核酸酶（“基因剪刀”）切割靶DNA产生双链断裂。Cas9分为识别叶（REC，含REC1与REC2结构域，结合gRNA）与核酸酶叶（NUC，含RuvC、HNH与PAM相互作用结构域，负责切割与PAM识别）。gRNA由CRISPR RNA（crRNA，18–20 bp，识别靶DNA互补序列）与反式激活crRNA（tracrRNA，作为Cas9结合支架）组成，二者可融合为单链向导RNA（sgRNA）用于任意基因序列编辑。
除Cas9外，Cas12（Cpf1）属II类V型系统，产生交错切口而非平末端，PAM为T-rich序列（如TTTV），且仅需单crRNA，简化了设计与递送。Cas13属II类VI型系统，独特靶向单链RNA而非DNA，可实现基因表达的瞬时调控，其RNA靶向能力已被用于SHERLOCK等RNA诊断平台。此外，碱基编辑可在不产生活性氧的情况下实现单核苷酸精准转换；引物编辑结合Cas9切口酶与逆转录酶，可实现靶向插入、缺失及所有12种点突变，进一步扩展了编辑工具箱。
6.2 Fanzor（Fz）
Fz是真核生物TnpB-IS200/IS605样蛋白，由转座子编码。其与OMEGA系统中的TnpB具有远缘同源性，可能代表真核版本的CRISPR-Cas或OMEGA系统。Fz与现有CRISPR-Cas系统的关键差异在于：天然编码于真核基因组，可能改善细胞兼容性、表达与核定位；体积紧凑（400–700 aa），更易通过病毒载体或纳米颗粒递送；使用ωRNA引导DNA切割，可能具有独特的靶向规则与切割模式（平末端或交错切口）；相比ZFNs、TALENs等蛋白核酸酶，其RNA引导的可编程性简化了工程设计并可能降低脱靶效应。Fz通过提供轻量、真核优化的RNA引导平台，扩展了超越原核Cas酶的核酸酶库，为精准基因组操作提供了新机遇。
6.3 其他传统基因组编辑平台
锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）与归巢核酸酶等早期技术为靶向基因组修饰奠定了基础，但因设计复杂、递送效率低、可扩展性差与脱靶效应等问题，在SCD治疗中的临床应用有限，目前主要具有历史与比较意义。
6.4 CRISPR治疗SCD的局限性
尽管CRISPR疗法取得积极临床结果，仍存在多重局限：脱靶基因组编辑风险可能导致意外遗传改变，尽管高保真Cas变体与gRNA设计降低了风险，但完全消除仍具挑战；造血干祖细胞（HSPCs）的高效递送依赖复杂的体外操作与自体移植，技术复杂、资源密集且难以普及；编辑效率与干细胞植入的个体差异可能影响治疗持久性与临床结局；长期安全性（如编辑细胞持续表达、潜在基因毒性与未知晚期不良反应）仍需长期随访；高昂成本、基础设施需求与监管复杂性限制了全球可及性，尤其在SCD负担最重的中低收入国家。这些挑战凸显了对基因组编辑技术持续创新的必要性，也支持了Fz等替代平台的探索。
7 CRISPR与Fanzor在镰状细胞病中的临床批准与转化应用
7.1 CRISPR在SCD中的临床应用
CRISPR-Cas9在SCD治疗中形成两大策略：基因校正与基因破坏。基因校正聚焦修复HBB致病突变，通过CRISPR-Cas9引入精准编辑，替换缺陷序列以恢复正常血红蛋白（HbA）表达，例如CRISPR_SCD001疗法通过电穿孔将CRISPR组件直接递送至HSPCs（无需病毒载体），编辑后的干细胞回输患者可维持健康红细胞生成，提供终身治愈潜力。类似策略利用HSCs或诱导多能干细胞（iPSCs）已显示出恢复HbA水平并降低镰变血红蛋白的成效。
基因破坏旨在重新激活胎儿血红蛋白（HbF）以抑制红细胞镰变，通过靶向BCL11A增强子或γ-珠蛋白启动子等调控元件，破坏其功能以提高HbF表达。例如，编辑LRF结合位点或HBG1/HBG2启动子区域已在患者来源HSPCs中证实可增强HbF合成，显著减少镰变并缓解症状；靶向BCL11A（γ-珠蛋白的关键抑制因子）尤为有效，可增加γ-珠蛋白水平并改善SCD表型。移除δ-与β-珠蛋白基因片段也可进一步重新激活HbF合成。尽管探索了多个靶点，破坏BCL11A与KLF1等主要调控因子似乎能产生最具治疗意义的HbF升高。
这两类策略在临床前模型与早期临床试验中均显示出鼓舞人心的结果。2023年沙特食品药品监督管理局（SFDA）批准Casgevy，标志着CRISPR疗法从实验室走向临床的重大里程碑。该疗法由Vertex Pharmaceuticals与CRISPR Therapeutics联合开发，通过提取患者骨髓干细胞、体外编辑纠正遗传缺陷并回输，实现持续治疗获益。然而，脱靶效应、长期安全性与递送方法优化仍是持续研究的重点，正在进行的临床试验将进一步评估其疗效与安全性，最终确定其在SCD治疗中的角色。
7.2 Fanzor在SCD中的转化潜力
Fz作为真核生物中发现的新型RNA引导DNA切割酶，在治疗包括SCD在内的遗传病中具有显著潜力。其核心优势在于紧凑体积（400–700 aa，远小于CRISPR-Cas系统的1000–1600 aa），极大提升了与腺相关病毒血清型6（AAV6）的载体兼容性——AAV6是HSPCs高效转导的常用载体，Fz较小的编码序列可更高效地包装入AAV6有限的载量（约4.7 kb），从而提高HSPCs中的递送效率、降低载体负荷并改善基因转移保真度。这一尺寸优势使其成为下一代体内基因组编辑策略的有力候选，而这正是当前SCD基因疗法的未满足需求。
此外，部分Fz蛋白（尤其真菌来源）表现出极低的“旁系活性”，降低了意外降解邻近RNA或DNA的风险，实现更精准的靶向编辑。与CRISPR类似，Fz具有高度可编程性，可定制靶向特定基因组位点，适用于多种遗传病。其真核起源可能减少细菌来源核酸酶的免疫原性与生物安全问题，有助于监管审批与公众接受。
尽管Fz尚未在SCD中专门测试，但其能力提示可应用于类似策略：沉默BCL11A等基因以提升胎儿血红蛋白（已知可缓解SCD症状）；直接纠正HBB致病突变；工程化患者HSPCs用于自体细胞治疗（避免供体依赖并降低排斥风险）。这些特征表明，Fz原则上可支持更紧凑、潜在免疫原性更低的血红蛋白病编辑平台，前提是其在人类HSPCs中的活性能接近临床验证的CRISPR-Cas9系统。
然而，Fz转化为常规临床实践仍需克服若干障碍：当前数据显示其在人类细胞中的编辑效率低于成熟CRISPR核酸酶，尽管蛋白质工程已实现活性数量级提升；需严格表征其靶向性能、脱靶谱与长期基因组安全性以满足首次人体研究的监管标准；针对组织或细胞类型的特异性递送解决方案（尤其是体内HSPC编辑）仍有待完善。从监管与伦理角度看，Fz的真核起源优势尚属推测，需通过系统的免疫原性与安全性数据支持。与所有基因组编辑技术一样，Fz的负责任应用需围绕生殖系风险、脱靶事件严格控制与全球公平性进行治理，尤其惠及SCD高负担人群。
综上，Fz不应被视为CRISPR-Cas9的短期替代品，而是互补平台，其优势可能在向可扩展、体内、低免疫原性
