一种完全集成的样本到答案分子诊断平台用于快速鉴定4种主要曲霉属（Aspergillus）物种

《Frontiers in Microbiology》：A fully integrated sample-to-answer molecular diagnostic platform for rapid identification of four major Aspergillus species

背景：侵袭性肺曲霉病（IPA）在免疫功能低下患者中更为常见。及时诊断至关重要，但目前的诊断方法常受到灵敏度低、周转时间长以及技术复杂等限制。本研究开发了一种基于实时聚合酶链式反应（PCR）的全自动“样本到答案”分子诊断平台，用于同时鉴定4种主要曲霉属（Aspergillus）物种，即烟曲霉（A. fumigatus）、黄曲霉（A. flavus）、黑曲霉（A. niger）和土曲霉（A. terreus）。

材料与方法：研究人员采用人工支气管肺泡灌洗液（BAL）样本，并加入曲霉属物种进行加样，优化了“样本到答案”工作流程。平台性能通过两个主要验证步骤进行评估：其一，采用21株来源于患者的培养分离株，与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行分析一致性验证；其二，采用22份临床BAL标本进行临床可行性验证，这些患者被归类为确诊（proven，n = 11）或临床拟诊（probable，n = 11）IPA。

结果：对于培养分离株，该检测与MALDI-TOF总体一致性为95.2%（20/21），阳性一致率为93.3%，阴性一致率为100%。在纳入11例确诊和11例临床拟诊IPA病例的22份患者BAL样本可行性验证中，该平台检出11份确诊IPA样本中的10份（90.9%），且种水平结果与MALDI-TOF达到100%一致。值得注意的是，在11例培养阴性的临床拟诊IPA病例中，该检测可为其中3例补充真菌学证据。

结论：该全自动“样本到答案”平台能够在疑似IPA中实现对曲霉属（Aspergillus）的快速且准确的种水平鉴定。研究结果表明，该检测为克服临床环境中传统诊断方法局限性提供了一种有力的分子工具。

该文发表于《Frontiers in Microbiology》，围绕侵袭性肺曲霉病（IPA）的快速分子诊断需求，开发并评估了一种完全集成的“样本到答案”自动化检测平台MoiM Dx，用于直接从支气管肺泡灌洗液（BAL）中鉴定4种主要曲霉：烟曲霉（A. fumigatus）、黄曲霉（A. flavus）、黑曲霉（A. niger）和土曲霉（A. terreus）。研究背景在于，IPA主要发生于血液系统恶性肿瘤、造血干细胞移植、实体器官移植及接受免疫抑制治疗的人群，病死率高，且早期规范使用伏立康唑或两性霉素B等抗真菌药物依赖于及时、准确的病原学诊断。然而，传统真菌培养和组织病理学检查虽然仍是确诊的重要依据，但存在耗时长、灵敏度不足的问题，特别是在已接受抗真菌治疗的患者中更易出现阴性结果。半乳甘露聚糖（GM）和β-D-葡聚糖等血清学或抗原检测虽然更快捷，但受交叉反应和感染部位差异影响较大。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）可用于培养后菌种鉴定，但仍依赖活菌培养，且样本制备繁琐、数据库质量影响显著，近缘曲霉种间鉴定仍具挑战。因此，建立一种可直接作用于临床标本、操作简便、全自动、并能实现种水平鉴定的分子诊断方法具有明确临床意义。

为解决上述问题，研究人员构建了MoiM Dx平台。该系统由自动分析仪和一次性反应卡匣组成，卡匣内预装样本处理、DNA提取、靶标扩增及荧光检测所需全部试剂。检测流程中，操作者仅需加入200 μL样本并启动程序，其后DNA提取、实时PCR扩增和结果判读均自动完成，约120 min内输出定性结果。研究针对4种目标曲霉分别设计了特异性引物和水解探针，靶向烟曲霉Cyp51A基因、黑曲霉CaM基因、黄曲霉SCW4基因及土曲霉CaM基因，并设置酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为内处理对照。由于平台具有4个独立PCR反应腔，研究构建了两个多重扩增组，以实现4种曲霉与1个内对照的5重检测。

主要技术方法可概括如下：研究首先基于NCBI序列比对完成引物-探针设计，并在常规实时荧光定量PCR平台验证单重与多重扩增性能及竞争抑制情况；随后采用裂解酶（lyticase）与蛋白酶K（proteinase K）相结合的酶法裂解策略，并联合磁珠法核酸提取，将DNA提取步骤整合入卡匣自动流程；之后以人工BAL加样样本优化整个平台热循环与提取参数；分析学特异性通过20种非目标微生物验证；临床评价包括韩国一家2,732张床位三级医疗中心2024年1月至12月收集的21株患者来源曲霉培养分离株，以及22份患者BAL标本，其中确诊IPA 11例、临床拟诊IPA 11例，并以MALDI-TOF为重要参照方法。

在结果部分，论文首先以“Qualitative PCR analysis for confirmation of primer and probe performance”为题，说明4个曲霉靶标在单重PCR中均表现出良好扩增性能。烟曲霉最低可稳定检测至每反应10个基因组当量拷贝，黄曲霉、黑曲霉和土曲霉可检测至5拷贝。进一步构建双重多重体系后，多重PCR与单重PCR的Ct值和检出限（LoD）基本等效，Ct变异系数（CV）总体较低，提示多重化未引入显著扩增干扰。不同靶标间竞争实验亦显示，即使两靶标浓度比例存在显著差异，共扩增条件下仍可稳定检出，表明靶标间竞争抑制效应有限。

在“Optimization of enzyme-based DNA extraction for integration into the MoiM Dx platform”部分，研究人员使用酿酒酵母作为真菌过程控制对象，比较不同酶裂解条件的DNA提取效率。结果显示，裂解酶联合蛋白酶K处理的平均Ct值最低，为27.86 ± 0.56，优于单用蛋白酶K和无酶预处理组，并与商业参考提取方法QIAamp UCP Pathogen Mini Kit得到的Ct = 28.19相近。这表明冻干裂解酶珠与蛋白酶K珠介导的酶法裂解具有可整合进自动化平台的可行性。

在“Integration and optimization of the sample-to-answer workflow”部分，研究首先优化了平台的PCR热循环参数，确定预变性95°C 5 min、变性95°C 9 s、退火/延伸63°C 20 s为适宜条件。随后将预装冻干PCR主混合物珠、裂解酶珠、蛋白酶K珠、过程控制珠、磁珠、提取试剂及热干燥引物探针组的卡匣用于人工BAL加样样本测试。与常规独立提取加实时PCR参考流程相比，MoiM Dx对烟曲霉和土曲霉的Ct值相近，而黄曲霉和黑曲霉Ct值延后约3–4个循环，提示卡匣内提取效率存在一定物种依赖性差异。但4种目标及内对照均可在40个循环内稳定检出，说明自动化样本到答案流程已成功建立。

在“Evaluation of assay specificity using non-target microorganisms”部分，研究通过20种潜在呼吸道、临床或环境相关非目标微生物评价分析学特异性，包括多种细菌和念珠菌。所有非目标物种在40个PCR循环内均未产生扩增信号，提示该检测在所测条件下未见明显交叉反应，具备良好分析学特异性。

在“Identification of patient-derived Aspergillus culture isolates”部分，研究以21株临床曲霉培养分离株评价种水平鉴定能力。按MALDI-TOF结果，其中15株属于检测靶标物种，6株为非目标曲霉。MoiM Dx正确鉴定了15株靶标中的14株，1株烟曲霉结果为阴性；6株非目标曲霉均报告为阴性并被视为类别一致。由此总体一致率为95.2%（20/21），阳性一致率93.3%（14/15），阴性一致率100%（6/6）。所有反应中内对照均成功扩增，证明检测流程有效。

在“Feasibility evaluation using patient BAL samples”部分，研究直接对22份BAL患者样本实施MoiM检测。其中11份为GM高值且培养阳性的确诊IPA样本，11份为GM升高或临界升高、培养阴性但结合临床特征归类为临床拟诊IPA的样本。结果显示，11例确诊IPA中检出10例，检出率为90.9%，且所有检出的病例在种水平上与培养/MALDI-TOF一致。另有2例出现双靶标结果，即A. fumigatus/A. flavus或A. fumigatus/A. terreus。对于11例培养阴性的临床拟诊IPA，MoiM检出3例，分别为2例烟曲霉和1例黄曲霉，提示该平台在培养阴性情境下可补充真菌学证据。论文还补充检测了67份无抗真菌治疗且无IPA临床表现者的BAL样本，其中3份MoiM结果阳性但培养阴性，提示低水平阳性结果的临床解释仍需结合具体情境。

讨论部分强调，传统培养、显微镜和组织病理学仍是病原真菌确证的重要依据，但种水平结果往往滞后于临床治疗决策。随着曲霉PCR已被纳入EORTC/MSGERC侵袭性真菌病定义中的真菌学标准之一，标准化、自动化、低人工干预的分子检测平台具有实际发展价值。本研究开发的MoiM Dx将酶法裂解、磁珠核酸提取、实时荧光PCR扩增与荧光信号检测整合在卡匣式系统中，减少了操作者依赖性，并通过较简化的液体处理架构降低了系统维护复杂度和潜在成本。研究同时指出，该平台仍存在局限：其一，卡匣内提取效率存在物种间差异，可能影响低真菌负荷样本的敏感性；其二，为实现可靠种水平区分，检测选用低拷贝靶基因而非核糖体DNA多拷贝区域，这一设计有助于特异性但可能牺牲部分分析灵敏度；其三，临床样本量有限，研究目的主要是验证可行性而非完成充分临床验证；其四，在无症状、培养阴性的个体中偶见阳性结果，提示气道定植、环境暴露或非活性真菌DNA残留均可能影响结果解释，因此单纯依据Ct值无法可靠区分定植与侵袭性感染，必须结合临床信息综合判断。

研究结论可译为：综合来看，这些结果提示MoiM Aspergillus 4-plex检测可作为疑似曲霉病中培养阳性与培养阴性病例的一种实用且信息量丰富的诊断工具。对BAL样本进行直接MoiM检测可检出11例确诊IPA中的10例，检出率为90.9%，且所有检出病例均与培养/MALDI-TOF在种水平上保持一致。两份BAL样本产生双靶标结果，提示气道内可能存在混合曲霉定植或共同感染。值得注意的是，在3例临床拟诊IPA中检出了2例烟曲霉和1例黄曲霉，而既往培养均无生长，提示在GM阳性但培养阴性的情形下，该检测可能提供额外真菌学证据，而这类情况下培养常因真菌负荷低或既往抗真菌治疗而失败。与此同时，对这些结果的解释仍需谨慎，因为阳性结果也可能反映气道定植、一过性环境暴露或非存活真菌DNA的存在，而非真实侵袭性疾病。总体而言，随着进一步优化与临床验证，该平台有望通过直接从呼吸道标本实现曲霉种水平鉴定，从而支持更及时、更恰当的临床决策。