Icariin 通过上调 ALKBH5 的表达来抑制前列腺癌中的糖酵解过程，从而调控 EARS2 的 m6A 甲基化清除（demethylation）

《Journal of Molecular Histology》：Icariin suppresses glycolysis in prostate cancer by upregulating ALKBH5 to mediate EARS2 m6A demethylation

摘要

前列腺癌（PCa）是男性中最常见的癌症之一。其发生和发展与代谢重编程密切相关，而异常活跃的糖酵解是维持其快速增殖的重要特征。近年来，人们对表观遗传修饰（尤其是N?-甲基腺苷（m?A）RNA甲基化）的调控作用越来越感兴趣。作为m?A去甲基酶的AlkB同源物5（ALKBH5）可能通过调节目标基因来影响PCa中的糖酵解过程，为机制研究和治疗提供了新的方向。首先使用Cell Counting Kit-8检测方法评估了不同浓度Icariin（ICA）对PCa细胞活力的影响，随后通过克隆形成试验（Colony Formation Assay）和Transwell试验（Transwell Assay）分别评估了ICA对细胞增殖和迁移的效应。凋亡通过 Annexin V-荧光异硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）双染色法检测。糖酵解的程度通过测量细胞外酸化率（ECAR）、氧气消耗率（OCR）以及葡萄糖、乳酸和三磷酸腺苷（ATP）的水平来评估。甲基化RNA免疫沉淀-PCR（methylated RNA immunoprecipitation-PCR）技术用于检测ICA对m?A甲基化的影响。甲基转移酶3类（METTL3）、METTL14、WTAP、脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）以及ALKBH5的信使RNA（mRNA）和蛋白质表达则分别通过定量实时PCR（quantitative real-time PCR）和Western blot技术进行检测。为了进行功能研究，构建了稳定敲低ALKBH5或过表达谷氨酰-tRNA合成酶2（EARS2）的PCa细胞系。利用放线菌素D（actinomycin D）实验确定了ALKB5敲低后EARS2 mRNA的半衰期，以评估mRNA的稳定性。RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）实验用于验证ALKBH5与EARS2 mRNA之间的相互作用。此外，还建立了异种移植模型以进行体内验证。免疫组化（immunohistochemistry, IHC）技术用于检测肿瘤组织中的蛋白质表达。ICA以浓度依赖的方式抑制了PCa细胞的增殖（降低细胞活力、减少克隆形成）、转移（削弱迁移和侵袭能力），并促进了细胞凋亡；在浓度低于25 μM时对细胞活力没有显著影响。ICA还以浓度依赖的方式抑制了PCa细胞中的糖酵解。25 μM ICA处理降低了整体m?A甲基化水平，并特异性上调了去甲基酶ALKBH5的mRNA和蛋白质表达，而其他m?A相关调控因子的表达并未受到显著影响。功能实验表明，ALKB5敲低或EARS2过表达促进了PCa细胞的增殖、转移和糖酵解（增加ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP水平及糖酵解相关蛋白质表达；降低OCR），并减弱了ICA对这些过程的抑制作用。RIP实验证实ALKB5与EARS2 mRNA相互作用，并且ALKB5通过m?A去甲基化机制降低了EARS2 mRNA的稳定性，从而下调其表达。在体内实验中，ICA有效抑制了小鼠肿瘤的生长。IHC结果显示ICA上调了肿瘤组织中ALKB5的表达，并下调了己糖激酶2（hexokinase 2）、乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A）和丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2）的表达。ALKB5敲低削弱了ICA的这些抑制效应。ICA通过抑制糖酵解来抑制PCa的进展，而ALKB5的激活促进了EARS2 mRNA的m?A去甲基化，导致其稳定性的降低。这些发现得到了进一步的内体验证。

前列腺癌（PCa）是男性中最常见的癌症之一。其发生和发展与代谢重编程密切相关，异常活跃的糖酵解是维持其快速增殖的重要特征。近年来，人们对表观遗传修饰（尤其是N?-甲基腺苷（m?A）RNA甲基化）的调控作用越来越感兴趣。作为m?A去甲基酶的AlkB同源物5（ALKBH5）可能通过调节目标基因来影响PCa中的糖酵解过程，为机制研究和治疗提供了新的方向。首先使用Cell Counting Kit-8检测方法评估了不同浓度Icariin（ICA）对PCa细胞活力的影响，随后通过克隆形成试验（Colony Formation Assay）和Transwell试验（Transwell Assay）分别评估了ICA对细胞增殖和迁移的效应。凋亡通过 Annexin V-荧光异硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）双染色法检测。糖酵解的程度通过测量细胞外酸化率（ECAR）、氧气消耗率（OCR）以及葡萄糖、乳酸和三磷酸腺苷（ATP）的水平来评估。甲基化RNA免疫沉淀-PCR（methylated RNA immunoprecipitation-PCR）技术用于检测ICA对m?A甲基化的影响。甲基转移酶3类（METTL3）、METTL14、WTAP、脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）以及ALKBH5的信使RNA（mRNA）和蛋白质表达则分别通过定量实时PCR（quantitative real-time PCR）和Western blot技术进行检测。为了进行功能研究，构建了稳定敲低ALKBH5或过表达谷氨酰-tRNA合成酶2（EARS2）的PCa细胞系。利用放线菌素D（actinomycin D）实验确定了ALKB5敲低后EARS2 mRNA的半衰期，以评估mRNA的稳定性。RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）实验用于验证ALKBH5与EARS2 mRNA之间的相互作用。此外，还建立了异种移植模型以进行体内验证。免疫组化（immunohistochemistry, IHC）技术用于检测肿瘤组织中的蛋白质表达。ICA以浓度依赖的方式抑制了PCa细胞的增殖（降低细胞活力、减少克隆形成）、转移（削弱迁移和侵袭能力），并促进了细胞凋亡；在浓度低于25 μM时对细胞活力没有显著影响。ICA还以浓度依赖的方式抑制了PCa细胞中的糖酵解。25 μM ICA处理降低了整体m?A甲基化水平，并特异性上调了去甲基酶ALKBH5的mRNA和蛋白质表达，而其他m?A相关调控因子的表达并未受到显著影响。功能实验表明，ALKB5敲低或EARS2过表达促进了PCa细胞的增殖、转移和糖酵解（增加ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP水平及糖酵解相关蛋白质表达；降低OCR），并减弱了ICA对这些过程的抑制作用。RIP实验证实ALKB5与EARS2 mRNA相互作用，并且ALKB5通过m?A去甲基化降低了EARS2 mRNA的稳定性，从而下调其表达。在体内实验中，ICA有效抑制了小鼠肿瘤的生长。IHC结果显示ICA上调了肿瘤组织中ALKB5的表达，并下调了己糖激酶2（hexokinase 2）、乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A）和丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2）的表达。ALKB5敲低减弱了ICA的这些抑制效应。ICA通过抑制糖酵解来抑制PCa的进展，而在这一过程中，ALKB5的激活促进了EARS2 mRNA的m?A去甲基化，导致其稳定性降低。这些发现得到了进一步的内体验证。