《Journal of Agriculture and Food Research》：Antifungal mechanism and ultrasonic nanoemulsion of Litsea cubeba (Lour.) Pers. essential oil against Aspergillus niger
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以柠檬醛（citral）为基础的精油（essential oil，EO），如山苍子[Litsea cubeba (Lour.) Pers.]精油（LCEO），对黑曲霉（Aspergillus niger）表现出强效抑制活性，因此有望作为天然防腐剂。本研究旨在进
以柠檬醛（citral）为基础的精油（essential oil，EO），如山苍子[Litsea cubeba (Lour.) Pers.]精油（LCEO），对黑曲霉（Aspergillus niger）表现出强效抑制活性，因此有望作为天然防腐剂。本研究旨在进一步开发LCEO纳米乳，首先阐明其主要成分柠檬醛对A. niger的抗真菌机制。通过测定与细胞凋亡相关的指标，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、酶活性、凋亡程度、细胞膜与细胞壁完整性，研究了柠檬醛对A. niger的抗真菌机制。在采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其组成后，利用超声法制备LCEO纳米乳，并通过高光谱显微技术监测其抗真菌效应。
结果表明，作为LCEO主要成分的柠檬醛（62.61%）可通过升高ROS含量、增强与一氧化氮（nitric oxide，NO）合成及凋亡相关酶的活性，并破坏A. niger细胞膜和细胞壁的完整性，从而诱导细胞凋亡。优化后的LCEO纳米乳表现出理想的理化性质，包括乳白色外观、近球形且分散均匀的液滴，平均粒径为119.8 nm（PDI = 0.216），具有较高包封率以及增强的水溶性。此外，该纳米乳还表现出优良的贮藏稳定性、缓释行为以及对A. niger的强抑制活性。研究结果表明，以柠檬醛为基础的精油能够抑制A. niger生长，为环境友好型抗真菌产品的开发提供了广阔前景。
该论文发表于《Journal of Agriculture and Food Research》，围绕山苍子精油（Litsea cubeba essential oil，LCEO）对黑曲霉（Aspergillus niger）的抑制作用展开，重点回答了两个相互衔接的科学问题：其一，LCEO中发挥主要作用的活性成分究竟通过何种细胞学与生化学途径抑制黑曲霉；其二，如何通过制剂工程手段克服精油水溶性差、挥发性强和稳定性不足等应用瓶颈，使其更适合食品防腐场景。研究背景在于，黑曲霉是一类广泛存在的丝状真菌，易在潮湿和适宜温度条件下迅速增殖，导致食品、农作物及工业设备霉变，不仅造成显著经济损失，还可能带来健康风险。随着对健康、安全与环境可持续性的关注上升，传统化学抗真菌剂面临耐药性增强等问题，开发来源天然、可降解且具广谱活性的防腐剂因此具有现实必要性。精油（EO）因哺乳动物安全性较好、可生物降解并对食源性病原体具有活性而受到重视，而富含柠檬醛（citral）的精油被视为潜在替代合成防腐剂的重要候选物。然而，已有研究虽已证实此类精油具有抗真菌效应，但其关键活性组分及分子作用机制仍缺乏系统阐明，同时LCEO实际应用也受制于理化性能缺陷，因此开展本研究具有明确的机制探索价值和应用转化意义。
研究人员首先从机制层面切入，分析LCEO的化学组成，并将其主要成分柠檬醛作为核心研究对象，系统评价其对A. niger的抑菌与促凋亡作用。在此基础上，进一步利用超声乳化技术构建LCEO纳米乳，以提升其溶解性、稳定性和持续释放能力，并结合显微成像手段评价其对真菌生长结构的抑制效果。研究最终表明，LCEO的主要活性成分为柠檬醛，后者可通过诱导活性氧积累、增强一氧化氮相关酶活性、激活Caspase-9并破坏细胞膜和细胞壁完整性，触发A. niger发生凋亡；同时，优化得到的LCEO纳米乳具有较小粒径、较高包封率、良好水溶性、缓释性和贮藏稳定性，并对A. niger表现出明显抑制作用。该研究的重要意义在于，它将天然精油的抗真菌分子机制与制剂优化紧密结合，为LCEO作为绿色天然防腐剂的开发提供了实验依据，也为减少化学杀菌剂使用和降低相关环境污染提供了新思路。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下几类关键方法：其一，以气相色谱-质谱联用（GC-MS）解析LCEO化学组成；其二，以最小抑菌浓度（MIC）测定、流式细胞术（flow cytometry）Annexin V-FITC/PI双染、ROS探针检测、NOS/NR酶活测定、Caspase-9比色分析以及胞外核酸、可溶性蛋白和碱性磷酸酶（AKP）泄漏检测，系统评估柠檬醛对A. niger的凋亡诱导及细胞结构损伤；其三，采用超声乳化法制备纳米乳，并通过粒径、多分散指数（PDI）、透射电子显微镜（TEM）、包封率、缓释性和贮藏稳定性进行表征；其四，利用高光谱显微成像对纳米乳抑制A. niger的形态学效应进行可视化评估。样本方面，A. niger菌株购自National Center for Medical Culture Collections，并经河南省工业微生物菌种工程研究中心进一步验证。
以下结合论文“结果与讨论”部分各小标题，对研究内容进行凝练解读。
3.1.1. In vitro growth inhibition of A. niger
研究人员首先测定了柠檬醛对A. niger的体外生长抑制作用。结果显示，随着柠檬醛浓度升高，其抑菌效果逐渐增强；当浓度达到50 μL/mL时，可完全抑制A. niger生长，因此后续抗真菌机制研究均以该浓度开展。同时，LCEO本身的MIC为60 μL/mL。该结果说明柠檬醛是LCEO抗真菌效应的重要贡献成分，也提示其抑菌作用具有明显的剂量依赖性。
3.1.2. Citra-induced apoptosis in A. niger
在明确抑菌活性后，研究人员通过Annexin V-FITC/PI双染联合流式细胞术分析A. niger的凋亡情况。结果表明，经50 μL/mL柠檬醛处理后，A. niger存活细胞比例由98.18%下降至60.12%，提示柠檬醛不仅抑制生长，而且显著破坏细胞结构并诱导细胞死亡。该结果支持柠檬醛作用并非单纯静菌，而是涉及真菌细胞凋亡过程。
3.1.3. Citral-induced intracellular caccumulation
研究人员进一步检测细胞内ROS水平，以判断柠檬醛是否诱导氧化应激。结果显示，50 μL/mL柠檬醛处理后，A. niger细胞内ROS荧光强度显著高于对照组，表明胞内ROS大量积累。由于ROS升高是细胞凋亡的重要标志，该结果说明柠檬醛可能通过诱导氧化应激参与A. niger凋亡过程。
3.1.4. Citral modulates nitric oxide (NO) synthase activity in A. niger
为考察氮代谢相关信号在凋亡中的作用，研究人员测定了一氧化氮合成相关酶，即一氧化氮合酶（NOS）和硝酸还原酶（NR）的活性。结果表明，与对照相比，50 μL/mL柠檬醛可显著提高NOS和NR活性，提示柠檬醛促进NO生物合成。该发现表明，柠檬醛诱导的细胞死亡过程不仅伴随氧化应激增强，也涉及硝化应激相关通路的激活。
3.1.5. Citral activates Caspase-9 in A. niger
在凋亡执行层面，研究人员测定了线粒体途径关键起始酶Caspase-9的活性。结果显示，对照组4 h内Caspase-9活性无明显变化，而50 μL/mL柠檬醛处理2 h后其活性显著升高，且随处理时间延长持续增强。这说明柠檬醛能够激活A. niger中的Caspase-9，支持其通过线粒体介导凋亡途径抑制真菌生长。
3.1.6. Citral disrupts A. niger cell membrane integrity
研究人员随后从细胞结构损伤角度验证柠檬醛的作用。通过检测胞外核酸和可溶性蛋白泄漏，结果发现柠檬醛处理后，24 h时胞外核酸含量显著增加，同时胞外可溶性蛋白含量呈时间依赖性升高，说明细胞膜通透性与完整性受到明显破坏，胞内大分子发生外泄。该结果表明细胞膜是柠檬醛的重要作用靶位之一。
3.1.7. Citral demages A. niger cell wall
除细胞膜外，研究人员还检测了胞外AKP活性以评估细胞壁完整性。结果显示，50 μL/mL柠檬醛显著提高培养液中的AKP活性，且随作用时间延长而增强，8 h后细胞壁破坏基本完成。由此可见，柠檬醛对A. niger的损伤并不限于膜系统，还包括细胞壁结构破坏。
3.2. Chemical composition of LCEO
在明确单体活性机制的同时，研究人员利用GC-MS对LCEO进行了系统成分分析。结果共鉴定出44种成分，占精油总组成的98.9%；其中萜类化合物（terpenoids）占97.66%，为绝对优势化学类别。柠檬醛（含α-citral和β-citral）含量最高，占62.61%，其次为D-柠檬烯（D-limonene，21.14%）。这一结果从化学组成层面确认了柠檬醛作为LCEO主要化学标志物和关键活性成分的地位。
3.3.1. Particle size and visual stability assessment
针对LCEO应用受限问题，研究人员构建了纳米乳体系，并首先考察不同油相比对粒径和外观稳定性的影响。结果表明，随着油相中LCEO比例增加，纳米乳粒径逐渐减小。不同LCEO:MCT体积比在4°C储藏20 d后的分层情况不同，其中1:2分层明显，1:1轻微分层，2:1几乎不分层。因此，研究人员将2:1确定为后续实验的最优油相比例。
3.3.2. Physicochemical properties
在优化配方基础上获得的LCEO纳米乳平均粒径为119.8 nm，PDI为0.216，TEM观察显示液滴近球形且分散均匀。外观上表现为均一乳白色悬液，长时间储藏后无明显分层。这说明所制备纳米乳具有良好的分散性和物理稳定性，满足纳米级制剂基本要求。
3.3.3. Water solubility enhancement
通过亚甲蓝扩散试验，研究人员比较了去离子水、LCEO原油和LCEO纳米乳的扩散表现。结果显示，纳米乳的水相分散性明显优于LCEO原油，说明纳米乳化显著改善了LCEO的水溶性。这一性质提升对其在水基食品体系中的应用具有直接意义。
3.3.4. Encapsulation efficiency (EE)
以柠檬醛为指标成分测定包封率后发现，LCEO纳米乳的平均包封率达到75.9%。该数值反映出纳米乳对主要活性成分具有较好的包载能力，也说明该制剂在减少挥发和保护活性物质方面具有优势。
3.3.5. Sustained release behavior
在缓释性能评价中，研究人员通过顶空GC-MS比较了LCEO原油与纳米乳中柠檬醛的挥发行为。结果表明，在前12 h内，原油中柠檬醛的累计挥发量明显高于纳米乳；3 h时的质谱分析也证实纳米乳中的柠檬醛挥发性更低。由此可见，纳米乳化可有效延缓柠檬醛逸散，使LCEO获得持续释放特征。
3.3.6. Storage stability
研究人员进一步考察了不同温度下的储藏稳定性。结果显示，在4°C储藏30 d后，粒径仅由119.8 nm轻微增至126.4 nm；25°C下粒径也基本稳定；而40°C时粒径增至184 nm，提示高温会削弱体系稳定性，但其仍维持纳米级范围。总体而言，该纳米乳在低温和室温条件下具有较好长期储藏适用性。
3.4. Effect of LCEO nanoemulsion on A. niger growth
在抗真菌应用验证部分，研究人员利用高光谱显微成像观察LCEO纳米乳对A. niger分生孢子头和菌丝荧光信号的影响。结果显示，在60 h稳定生长期内，随着纳米乳浓度由0、10、20增至30 μg/mL，A. niger分生孢子梗逐渐萎缩，在30 μg/mL时仅残留顶囊结构，表明较高浓度纳米乳可显著抑制其生长与繁殖结构形成。进一步的84 h连续动态观察发现，0和10 μL/mL组形态变化不大，20 μg/mL组分生孢子梗长度随时间逐渐缩短，而30 μg/mL组则不能形成分生孢子，顶囊明显萎缩。该结果说明LCEO纳米乳能够持续释放活性成分，从而对A. niger施加长期抑制作用，并在较高浓度下更快阻断其繁殖过程。
综合讨论部分可见，本研究形成了一条较为完整的证据链：首先，化学组成分析确认LCEO属于典型富柠檬醛精油；其次，机制实验表明柠檬醛可诱导A. niger发生以ROS积累、NOS/NR活性升高和Caspase-9激活为特征的凋亡过程，并伴随细胞膜、细胞壁损伤及胞内物质外泄；再次，纳米乳化策略有效改善了LCEO原有的水溶性差、易挥发和稳定性不足等限制因素，使其在保留抗真菌活性的同时获得更好的包封、缓释和储藏性能；最后，高光谱显微成像从形态学层面验证了纳米乳对真菌繁殖结构的持续抑制作用。整项研究实现了“活性机制阐明—制剂构建—功能验证”的连贯衔接，增强了LCEO作为天然抗真菌产品候选物的可应用性。
研究结论部分可译述如下：本研究采用超声乳化法成功制备了山苍子精油（LCEO）纳米乳，其组成为6% Tween 80、78% PBS、15% LCEO-MCT混合油相（2:1）和1%甘油。该制剂具有良好理化性质，包括较小液滴粒径（119.8 nm）、较高包封率（75.9%）、增强的水溶性、缓释特性和较好的贮藏稳定性，并对黑曲霉（A. niger）表现出显著抗真菌活性。化学成分分析表明，柠檬醛（62.61%）是LCEO中的主要活性成分。机制研究显示，50 μg/mL柠檬醛可通过多环节凋亡通路抑制A. niger：其诱导细胞内ROS积累，上调NOS与NR活性以增强硝化应激，并激活线粒体介导凋亡的关键起始因子Caspase-9。上述变化最终导致细胞膜和细胞壁完整性受损，表现为核酸、蛋白质和碱性磷酸酶外泄。总体而言，该研究表明，以柠檬醛为主要活性基础的LCEO纳米乳是一种具有开发潜力的环境友好型天然抗真菌体系，可为食品保藏领域提供可持续替代方案。
