《Journal of Contextual Behavioral Science》：Trace PEG-lipid engineering unlocks superior mRNA delivery via albumin-mediated liver targeting and enhanced endosomal escape
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方思思|唐旭英|欧炳倩|钱顺祥|陈波|苏金双|冯杰|袁哲凡|张静中国浙江省高级分离膜材料国家重点实验室，浙江省高级聚合物材料改性与应用技术重点实验室，浙江工业大学材料科学与工程学院，杭州310014，中华人民共和国摘要脂质纳米颗粒（LNPs）是mRNA递送领域的领先非病毒平台，但
方思思|唐旭英|欧炳倩|钱顺祥|陈波|苏金双|冯杰|袁哲凡|张静
中国浙江省高级分离膜材料国家重点实验室，浙江省高级聚合物材料改性与应用技术重点实验室，浙江工业大学材料科学与工程学院，杭州310014，中华人民共和国
摘要
脂质纳米颗粒（LNPs）是mRNA递送领域的领先非病毒平台，但实现高效的组织特异性靶向和细胞质释放仍具有挑战性。本研究通过改造微量PEG脂质的结构来解决这一问题——PEG脂质是LNPs中的次要但关键成分。构建了一个包含45种新型PEG脂质的库，并发现Pr-181-277（具有不对称连接基团）是一种有效的肝脏mRNA递送增强剂。用Pr-181-277替换标准LNPs中的传统PEG脂质后， luciferase mRNA的表达增加了4.5倍，Cre介导的基因编辑效率在肝脏中提高了5.3倍。机制研究表明存在一种协同的两步机制：1）在体内环境中，Pr-181-277促进富含白蛋白的蛋白质冠层的形成，这可以解释其在肝脏中的积累现象；2）其结构同时增强了膜的不稳定性，从而促进了快速的内体逃逸和货物释放。我们的工作表明，对PEG脂质结构进行最小限度的合理改造可以协同克服细胞外和细胞内的障碍，为基于LNPs的疗法提供了一种强大且简单的策略。
引言
COVID-19 mRNA疫苗的成功应用确立了脂质纳米颗粒（LNPs）作为RNA疗法的主要非病毒递送平台[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。一个标准的LNPs由四个关键成分组成：可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG脂质）。尽管大量研究集中在改造可电离脂质以提高疗效或靶向性[9]上，但PEG脂质的作用尽管是次要成分，却具有多方面的影响。它通过调节颗粒稳定性、血清蛋白吸附、生物分布、细胞摄取和内体逃逸，对LNPs的物理化学性质、药代动力学和生物学命运起着关键作用[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。
LNPs的体内旅程受到两个决定性界面事件的影响。首先，在静脉注射后，LNPs立即被血浆蛋白包裹，形成一层“蛋白质冠层”，这层冠层作为生物标识，引导细胞识别、清除和器官趋向性[17]、[18]。其次，在细胞内化后，有效的“内体逃逸”是决定核酸载荷是否能够到达细胞质发挥功能或在溶酶体中被降解的关键瓶颈[19]。因此，能够同时穿透细胞外蛋白质冠层并促进细胞内内体破裂的策略对于高效的mRNA递送至关重要。
PEG脂质的结构是这些过程的关键决定因素。历史上，其功能主要归因于PEG链的解离动力学（“PEG脱落”[20]）。最近的研究，如末端氟化，表明定制的修饰可以通过改善细胞摄取和内体逃逸来增强递送效果[21]、[22]。然而，系统的理解仍然有限。以往的研究往往只关注单一的结构方面——如PEG分子量或疏水尾部长度——而头部基团[23]、连接基团和尾部结构的综合影响尚未得到充分探索。特别是，连接基团在调节蛋白质冠层形成和后续生物运输中的作用尚不清楚，这在合理设计用于靶向递送的PEG脂质方面造成了知识空白[24]、[25]、[26]。
为了解决这个问题，通过高效的Ugi和Passerini多组分反应构建了一个包含45种新型PEG脂质的库，从而能够系统地改变头部基团、连接基团和尾部。通过体内筛选，发现具有独特连接基团的不对称PEG脂质Pr-181-277是一种显著增强mRNA向肝脏递送的关键化合物。用Pr-181-277替换基准LNPs中的传统PEG脂质后， luciferase mRNA的表达增加了4.5倍，Cre介导的基因编辑效率在肝脏中提高了5.3倍。机制研究表明存在一种协同的两步机制：1）在体内环境中，Pr-181-277促进富含白蛋白的蛋白质冠层的形成，从而促进肝脏特异性积累；2）其不对称连接基团同时增强了膜的不稳定性，在富含蛋白质的环境中这种不稳定性得到增强，从而实现快速的内体逃逸。这项工作表明，对微量PEG脂质成分进行最小限度的合理改造可以协同克服细胞外和细胞内的障碍，为基于LNPs的基因疗法提供了一种强大且简化的策略。
章节片段
化学品和材料
以下化学品和材料均从各自制造商处采购：SM-102、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）和胆固醇（AVT（上海）制药技术有限公司，美国密苏里州圣路易斯）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素-链霉素溶液和比色蛋白测定试剂盒（Beyotime生物技术公司，中国上海）；ONE-Glo+Tox荧光素酶报告系统（Promega公司，美国威斯康星州麦迪逊）；
PEG脂质库的合成、筛选和候选LNPs的表征
为了系统研究PEG脂质结构如何影响mRNA递送，通过模块化的Ugi（4组分）[27]、[28]和Passerini（3组分）[30]、[31]多组分反应（图1A，图S1）构建了一个包含45种新型分子的库。这种方法能够高效地组合改变四个关键模块：两个疏水尾部、一个化学连接基团和亲水PEG链，同时保持共同的PEG2K头部基团[33]。所有PEG脂质均根据……进行命名
结论
总之，这项工作表明，通过最小的配方改进——仅合理改造微量PEG脂质成分，而不改变核心的可电离脂质、辅助脂质或胆固醇组成——就可以显著提高临床应用的脂质纳米颗粒（LNPs）的递送效率。通过对定制的PEG脂质库进行系统筛选，发现Pr-181-277（具有不对称的Passerini衍生连接基团）是一种关键的修饰剂
CRediT作者贡献声明
方思思：撰写——原始草稿、验证、软件使用、实验设计、数据分析、数据管理。唐旭英：实验设计。欧炳倩：实验设计、数据管理。钱顺祥：资源准备。陈波：资源准备。苏金双：实验设计。冯杰：指导监督。袁哲凡：指导监督、资源准备、方法学设计、概念构思。张静：撰写——审稿与编辑、指导监督、项目管理、资金获取、概念构思。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号52073256）的资助。作者感谢浙江工业大学实验动物中心为这项研究提供的动物设施和技术支持。
