霍尔德巴氏杀菌对人乳蛋白质组的影响及其基于通路分析的功能推断

《Journal of Food Composition and Analysis》：The Impact of Holder Pasteurisation on the Human Milk Proteome and Its Functionality Inferred by Pathway Analysis

研究人员针对母乳库为确保微生物安全而采用的霍尔德巴氏杀菌（Holder Pasteurisation, HoP）（62.5 ℃维持30分钟）处理捐赠人乳（donated human milk, DHM）的过程，采用傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）及纳升液相色谱-电喷雾串联质谱（nanoscale liquid chromatography with electrospray ionisation coupled to tandem mass spectrometry, nanoLC-ESI-MS/MS）分析其对人乳蛋白质组的影响。FTIR结果显示酰胺Ⅱ带吸收降低、酰胺Ⅲ带吸收升高，提示蛋白质构象改变及蛋白-脂质波段的变动。MALDI-TOF MS分析表明HoP处理后肽谱发生变化。nanoLC-ESI-MS/MS共鉴定出2162种蛋白质，其中2015种在生乳与HoP处理样品间共有。尽管主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）与层次聚类未显示明显分组差异，但通路富集分析显示HoP处理后人乳中血小板活化及能量代谢通路显著富集，而生乳中蛋白质合成、细胞信号传导及免疫反应相关蛋白（包括IL-12的产生）比例更高。研究表明HoP可能影响人乳的免疫调节功能相关通路，但这些功能变化是基于通路分析的推断，仍需进一步的实验验证。

本研究发表于《Journal of Food Composition and Analysis》，聚焦于捐赠人乳（DHM）在霍尔德巴氏杀菌（HoP）处理过程中蛋白质组的变化及其潜在功能影响。人乳是早产儿及患病婴儿的首选营养来源，其蛋白质组分不仅提供必需营养，还直接参与免疫调节、肠道发育及菌群调控。然而，为保障微生物安全，母乳库普遍采用HoP处理，该过程已被证实会导致部分生物活性蛋白失活，但其对整个蛋白质组及相关生物学通路的系统性影响尚未被充分解析。为此，研究人员利用多种质谱与光谱技术，结合生物信息学通路分析，探讨HoP对人乳蛋白质组结构与功能的综合作用。

在方法学上，研究人员获得伦理批准后，从澳大利亚红十字会生命血液中心采集10份成熟乳样本，分别保留为生乳组和经HoP处理的实验组。关键技术包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测蛋白构象变化，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析肽段分布，以及纳升液相色谱-电喷雾串联质谱（nanoLC-ESI-MS/MS）进行蛋白质组的定性与定量分析。数据经MaxQuant软件匹配至人类SwissProt数据库，并通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、Reactome及基因本体（Gene Ontology, GO）工具进行通路富集分析。

研究结果如下：

总蛋白含量：BCA法测定显示，生乳与HoP处理后总蛋白浓度分别为2.556±0.091 g/100 mL与2.917±0.185 g/100 mL，差异无统计学意义（p=0.1155）。

FT-IR光谱分析：酰胺Ⅰ带（1651 cm^-1）和酰胺Ⅱ带（1547 cm^-1）在生乳中吸收更强，提示HoP减弱了蛋白-脂质-水的相互作用；酰胺Ⅲ带（1259 cm^-1）在HoP后吸收增强，反映热诱导的肽键振动增强。脂类相关甲基（CH₂）基团在2923 cm^-1与2852 cm^-1处吸收增加，提示脂肪球结构变化及脂质-蛋白复合物形成。PCA分析显示前两个主成分可解释83.8%的变异，并有效区分生乳与HoP样品。

MALDI-TOF MS分析：在5–20 kDa范围内，HoP样品在低分子量区（5–10 kDa）峰数及强度增加，可能源于大分子蛋白降解。但PCA未能清晰分离两组，主要受供体间个体差异影响。

nanoLC-ESI MS/MS分析：共鉴定2162种蛋白质，生乳组2093种，HoP组2084种，共有2015种。热图与层次聚类将差异蛋白分为两簇：簇1（18种蛋白）在生乳中丰度更高，包括谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、钙结合蛋白39（CAB39）等；簇2（49种蛋白）在HoP样品中丰度更高，包括DNAJB6、CD59等。通路分析显示，生乳中富集免疫应答、IL-12信号传导及血小板脱颗粒通路；HoP样品中富集血小板活化、血栓素信号、胰岛素分泌调节及能量代谢通路。GO与KEGG分析进一步提示HoP可能影响钾通道调节活性、钙离子结合及神经递质相关通路。

讨论部分指出，HoP虽未造成单个蛋白丰度的显著差异，但通过通路水平的变化可能影响人乳的免疫调节、凝血及代谢功能。这些推断尚需功能性实验与临床研究验证。结论明确，HoP会改变人乳蛋白质组及其推断的功能特性，可能在保护婴儿免受感染及过敏方面产生影响，因此需在未来的研究中结合不同母乳库的操作模式加以评估。