《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Cyclovirobuxine D suppresses gastric cancer growth by targeting the V-ATPase complex and inducing excessive endo-lysophagy
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胃癌是全球恶性程度最高的肿瘤之一，严重威胁人类生命，仍是重大临床挑战。环维黄杨星D（Cyclovirobuxine D, CVB-D）源自黄杨属植物，传统用于心血管疾病治疗，已显示出成为抗癌候选药物的潜力，但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在全面评估CVB-D
胃癌是全球恶性程度最高的肿瘤之一，严重威胁人类生命，仍是重大临床挑战。环维黄杨星D（Cyclovirobuxine D, CVB-D）源自黄杨属植物，传统用于心血管疾病治疗，已显示出成为抗癌候选药物的潜力，但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在全面评估CVB-D对胃癌的影响并阐明其潜在机制。研究人员发现CVB-D可在胃癌中诱导过度内吞-溶酶体自噬。多组学分析揭示CVB-D直接结合含ATP6V0A1的V-ATP酶（Vacuolar-type H?-ATPase）复合物，扰乱内吞-溶酶体稳态，导致溶酶体酸化异常、溶酶体蛋白酶活性受损及自噬流阻滞。机制上，受损的内吞-溶酶体以半乳糖凝集素-8（galectin-8, Gal8）依赖的方式招募自噬衔接蛋白P62/SQSTM1，最终引发内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）应激及胃癌细胞凋亡。此外，通过细胞来源异种移植（Cell-derived xenograft, CDX）模型和患者来源异种移植（Patient-derived xenograft, PDX）模型，研究人员验证了CVB-D对胃癌的治疗效果。值得注意的是，CVB-D可增强胃癌对化疗药物顺铂的敏感性。上述结果表明，CVB-D有望成为治疗胃癌的有效候选药物。
研究背景与意义
胃癌是全球发病率和死亡率均居第五位的恶性肿瘤，对人类生命健康构成严重威胁。目前临床治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗及免疫治疗，但超过60%的患者确诊时已发生局部或远处转移，失去最佳手术时机，化疗成为晚期胃癌的主要治疗方式。然而肿瘤细胞产生的耐药性是导致肿瘤复发和转移的关键因素，克服化疗耐药是当前亟待解决的临床难题。溶酶体作为膜结合细胞器，不仅是细胞内的消化中心，还参与信号转导、代谢适应、细胞增殖分化及蛋白质与细胞器质量控制等多种生理过程，已成为癌症诊疗的重要靶点。环维黄杨星D（CVB-D）是从黄杨中提取的甾体生物碱，也是黄杨宁片的主要成分，在中国临床应用数十年用于治疗心血管疾病，安全性良好。既往研究显示其在多种癌症中发挥抗肿瘤活性，但具体分子靶点和机制尚不完全清楚。本研究由西南大学等单位的研究人员完成，发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》，旨在探究CVB-D在胃癌治疗中的应用潜力及其分子机制。
关键技术方法
研究人员采用6种人胃癌细胞系和1种正常胃上皮细胞系作为体外研究样本，并使用细胞来源异种移植（CDX）模型、患者来源异种移植（PDX）模型及顺铂耐药胃癌细胞系作为体内及功能验证样本。关键技术包括：通过多组学分析筛选靶点，利用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）实验验证小分子与蛋白的直接结合，采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和邻近连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）分析蛋白互作，结合细胞热位移实验（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）验证药物靶点结合，并通过转录组测序（RNA-seq）分析通路变化。
研究结果
3.1 CVB-D在体内外抑制胃癌细胞生长
体外实验显示CVB-D对6种胃癌细胞系的半数抑制浓度（Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50）显著低于正常胃上皮细胞GES-1，并能有效抑制胃癌细胞集落形成与DNA合成，将细胞周期阻滞于G0/G1期。体内实验通过CDX和PDX模型证实，每日腹腔注射20 mg/kg CVB-D可显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤组织中增殖标志物Ki67的表达，且未引起明显器官毒性。
3.2 CVB-D阻滞胃癌细胞自噬流
透射电镜、串联标记mRFP-GFP-LC3B系统及Western blot检测均表明CVB-D显著诱导自噬，但与自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin, Rapa）联用未进一步增强自噬水平，而与自噬晚期抑制剂巴菲霉素A1（Bafilomycin A1, BafA1）联用则显著降低自噬水平，提示自噬流发生阻滞。进一步检测发现CVB-D导致溶酶体pH值降低，组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB）和组织蛋白酶D（Cathepsin D, CTSD）成熟受阻，自噬体-溶酶体融合关键蛋白STX17表达下调。
3.3 CVB-D诱导胃癌细胞发生内吞-溶酶体自噬
免疫荧光显示LC3B与溶酶体标志物LAMP1高度共定位，且与晚期内吞体标志物Rab7共定位随处理时间延长而增加，与早期内吞体标志物Rab5无显著共定位，证实CVB-D诱导选择性内吞-溶酶体自噬。溶酶体损伤标志物半乳糖凝集素家族中，Gal8与LC3B共定位最为显著。敲低已知溶酶体自噬衔接蛋白TRIM16可部分降低CVB-D诱导的自噬水平。
3.4 P62作为衔接蛋白介导CVB-D诱导的内吞-溶酶体自噬
免疫荧光和PLA实验显示P62与LC3B及Gal8在CVB-D诱导的空泡周围存在空间邻近。结构域分析表明P62通过其LIR结构域与LC3B结合，通过UBA结构域与Gal8结合，且泛素分子参与该招募过程，K33和K48连接的泛素链可能发挥重要作用。敲低P62或Gal8可显著减弱CVB-D诱导的自噬。
3.5 ATP6V0A1包含的V-ATP酶复合物是CVB-D的直接结合靶点
分子对接、SPR、CY5标记的CVB-D pull-down及CETSA实验均证实CVB-D直接结合V-ATP酶的V0域亚基ATP6V0A1。敲低ATP6V0A1可显著恢复CVB-D诱导的细胞空泡化和自噬表型，表明ATP6V0A1是CVB-D发挥功能的关键靶点。
3.6 CVB-D通过调控mTOR-TFEB/TFE3通路诱导内吞-溶酶体自噬
转录组KEGG富集显示溶酶体通路显著改变。Western blot显示CVB-D抑制mTOR磷酸化，促进转录因子TFEB和TFE3入核。敲低TFEB或TFE3可显著抑制CVB-D诱导的自噬，表明该通路是CVB-D发挥作用的重要机制。
3.7 CVB-D抑制顺铂耐药胃癌细胞体内外生长
长期诱导建立的顺铂耐药细胞系MKN-R2和HGC-R1对CVB-D仍敏感。CDX和PDX模型显示，CVB-D单药或联合顺铂均能显著抑制顺铂耐药肿瘤的生长，联合用药组肿瘤组织中LC3B表达升高，Ki67表达降低。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次阐明CVB-D通过靶向ATP6V0A1扰乱V-ATP酶功能，导致内吞-溶酶体稳态失衡，进而通过mTOR-TFEB/TFE3轴诱导过度内吞-溶酶体自噬及自噬流阻滞，最终引发胃癌细胞死亡。CVB-D与经典V-ATP酶抑制剂BafA1的作用不同，其引起溶酶体pH降低而非升高，且兼具自噬流阻滞与溶酶体损伤双重效应。此外，CVB-D通过靶向溶酶体逆转了肿瘤细胞的顺铂耐药，为克服临床化疗耐药提供了新策略。鉴于CVB-D已在临床应用数十年，安全性明确，本研究为其老药新用治疗胃癌提供了扎实的临床前证据。
结论部分翻译如下：
综上所述，本研究表明环维黄杨星D通过直接结合含ATP6V0A1的V-ATP酶复合物，破坏V-ATP酶相关的溶酶体稳态，激活mTOR-TFEB/TFE3轴，诱导伴有自噬流阻滞的过度内吞-溶酶体自噬，从而抑制胃癌的生长和致瘤性。值得注意的是，CVB-D处理还能显著减弱胃癌细胞的顺铂耐药性。这些发现为阐明CVB-D的抗癌机制提供了新的见解，支持其作为治疗胃癌的候选药物进行老药新用开发，并强调了内吞-溶酶体自噬在癌症治疗中依赖于具体情境的作用。
