《Nature Microbiology》：Wall teichoic acids regulate peptidoglycan synthesis to maintain rod shape in Bacillus subtilis
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杆状细菌如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）通过Rod复合物合成各向异性肽聚糖，并通过PBP1限制各向同性肽聚糖合成来实现其形态。细胞壁磷壁酸同样为杆状形态所必需，但其作用机制尚不清楚。本研究利用单细胞微流控与显微成像技术发现，细胞壁磷壁酸通过
杆状细菌如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）通过Rod复合物合成各向异性肽聚糖，并通过PBP1限制各向同性肽聚糖合成来实现其形态。细胞壁磷壁酸同样为杆状形态所必需，但其作用机制尚不清楚。本研究利用单细胞微流控与显微成像技术发现，细胞壁磷壁酸通过阻止枯草芽孢杆菌细胞壁中纳米级孔隙的形成来促进杆状形态维持。细胞壁磷壁酸耗竭可在数分钟内诱导孔隙形成，同时伴随PBP1介导的肽聚糖合成快速上调——该合成途径在此时成为生长必需——并在无定形生长开始前短暂抑制Rod复合物活性。一种合成致死细胞壁水解酶LytE在细胞壁磷壁酸耗竭过程中同样变为必需，表明在无磷壁酸条件下，PBP1与LytE协同驱动无定形生长。研究结果表明，细胞壁磷壁酸通过阻止细胞壁孔隙形成来维持细胞形态，从而促进Rod复合物活性并抑制PBP1活性。
本研究发表于《Nature Microbiology》，聚焦革兰阳性模式生物枯草芽孢杆菌的杆状形态维持机制。细菌细胞壁是决定细胞形态、保护细胞免受渗透压裂解并参与致病过程的核心结构，其主要由肽聚糖构成，革兰阳性菌的肽聚糖还共价修饰有细胞壁磷壁酸（wall teichoic acids, WTAs）——一类带负电的糖醇-磷酸亚基聚合物。既往研究发现，敲除磷壁酸合成关键基因tagO的突变体虽可存活，但生长速率降低约4倍且呈无定形形态，然而磷壁酸如何调控杆状发生的分子机制长期未明。现有模型认为，枯草芽孢杆菌的肽聚糖合成存在两条通路：一是必需的Rod复合物，通过沿细胞膜周质面进程性运动合成各向异性肽聚糖，为杆状形态提供力学基础；二是非必需的A类青霉素结合蛋白PBP1（由ponA编码），负责合成各向同性肽聚糖，被认为参与修复细胞壁孔隙。磷壁酸与这两条合成通路的互作关系此前缺乏直接证据，且无法解释其对杆状的必要性。
研究人员通过急性抑制磷壁酸合成，结合单细胞动态追踪、生化分析与超微结构观测，系统解析了磷壁酸的形态调控功能。研究发现，磷壁酸并非直接激活Rod复合物，而是通过物理填充肽聚糖孔隙维持细胞壁的致密性：磷壁酸耗竭后，纳米级孔隙暴露，触发PBP1通过其C端固有无序区感知损伤并上调表达与合成活性，PBP1由此成为无磷壁酸条件下的必需合成酶，驱动无定形生长；同时孔隙导致肽聚糖交联受体密度下降，直接抑制Rod复合物的进程性运动，最终造成杆状丧失。此外，合成致死水解酶LytE在磷壁酸耗竭时变为必需，二者协同实现稳定的无定形生长。该研究首次将细胞壁聚合物结构与合成机器活性直接关联，阐明磷壁酸通过调控细胞壁孔隙稳态维持杆状形态的机制，为理解细菌形态发生提供了全新视角。
关键技术方法方面，研究人员采用低浓度衣霉素（tunicamycin）急性抑制TagO酶活性，结合可诱导转录抑制系统调控tagO表达，在单细胞层面模拟磷壁酸耗竭。利用全内反射荧光显微镜追踪Rod复合物支架蛋白Mbl与MreB的动态运动，通过单分子追踪技术分析PBP1的扩散与定位变化。采用荧光D-氨基酸（HADA、EDA-DA）脉冲标记新生肽聚糖，结合高效液相色谱（HPLC）解析肽聚糖交联结构组成。开发基于荧光探针扩散的单细胞通透性检测体系，分别使用27.5 kDa的mNeonGreen与9.5 kDa的泛素-FlAsH探针表征不同尺度孔隙。通过纯化磷酸二酯酶GlpQ体外消化细胞壁磷壁酸，结合透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构变化，系统验证孔隙形成的动态过程。
研究结果部分，首先揭示“耗竭细胞壁磷壁酸在形态丧失前减慢生长”。微流控急性处理显示，衣霉素处理后约10分钟细胞生长速率首次下降，暂稳后二次下降，期间细胞先出现哑铃型中间态再完全丧失杆状，该表型在不同培养基与抑制方式下均一致。其次，“耗竭细胞壁磷壁酸降低Rod复合物活性”：磷壁酸耗竭后，进程性Rod复合物比例、空间密度与运动速度均显著下降，肽聚糖合成从均匀分布转为异常斑点状，ΔtagO突变体的肽聚糖单体比例升高，二聚交联减少，三聚与四聚交联呈上升趋势，与PBP1主导合成的特征吻合。第三，“无磷壁酸条件下PBP1活性为必需”：ΔponA突变体在衣霉素处理后无法维持无定形生长，广泛发生裂解；PBP1的糖基转移酶活性、转肽酶活性及C端固有无序区均为该功能所必需。单分子追踪显示磷壁酸耗竭后PBP1扩散显著降低，形成稳定合成斑点，且与新生肽聚糖位点共定位，同时PBP1表达水平上调。第四，“无磷壁酸与PBP1时细胞壁孔隙增加”：通透性检测发现，野生型磷壁酸耗竭后细胞壁通透性轻微下降，而ΔponA突变体中孔隙快速形成，2分钟内即可被9.5 kDa探针检测到；透射电镜显示ΔponA突变体细胞壁显著变薄并出现低密度区域，而野生型仅轻微减薄。第五，“lytE在磷壁酸耗竭过程中变为必需”：长期磷壁酸耗竭后，ΔlytE突变体无法生长，表明PBP1与LytE协同执行无定形生长。
讨论部分总结，研究提出“磷壁酸通过阻塞纳米级孔隙维持杆状形态”的工作模型：正常细胞中，磷壁酸通过填充或衬里肽聚糖孔隙，限制PBP1的固有无序区进入，抑制其合成活性；磷壁酸耗竭后，孔隙暴露触发PBP1快速激活，竞争脂质II前体并合成各向同性肽聚糖，导致Rod复合物因前体不足与受体密度过低而受抑，细胞转为无定形生长。ΔponA突变体中，孔隙无法被修复而持续扩大，最终阻断Rod复合物活性。研究同时指出，磷壁酸可能通过调控肽聚糖水解酶活性参与形态维持，GlpQ消化导致的不可逆生长缺陷或与水解失衡有关。该模型解决了磷壁酸不直接参与各向异性合成却为杆状必需的长期疑问，揭示细胞壁不仅是合成底物，更是自身合成的自调控因子，为抗菌药物研发提供了新的潜在靶点。
