《Virology》：Remdesivir and Favipiravir as potential antivirals for poliovirus: In vitro efficacy and RNA-dependent RNA polymerase binding analysis
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帕拉斯图·索赫伊利（Parastoo Soheili）|法尔沙德·科达卡（Farshad Khodakhah）|玛丽亚姆·尤塞菲（Maryam Yousefi）|赛义德·莫赫森·扎赫拉伊（Seyed Mohsen Zahraei）|苏珊·马哈茂迪（Sussan Mahmoudi）
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伊朗德黑兰医科大学公共卫生学院病毒学系
摘要
要彻底根除脊髓灰质炎病毒，需要控制慢性病毒排出者并防止潜在的疫情爆发。依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）抑制剂是实现这一目标的有希望的候选药物。本文分别和联合使用Remdesivir、Favipiravir和Ribavirin在HeLa细胞中对类似Sabin型的脊髓灰质炎病毒1型（SL1）和3型（SL3）的抗病毒活性进行了评估。抗病毒效果通过细胞病变效应抑制、MTT测定和qRT-PCR来测量。使用Synergy Finder Plus分析了药物间的相互作用，并通过分子对接技术评估了RdRp的结合亲和力。Remdesivir表现出中等活性，其EC50值分别为47 μM（SL1）和27 μM（SL3）；Favipiravir在较高浓度下也能抑制病毒复制；而Ribavirin对SL3无效，在3500 μM浓度下仅部分抑制SL1。联合治疗，尤其是Remdesivir和Favipiravir的组合，由于它们都作用于RdRp的活性位点，因此表现出拮抗作用。尽管三联药物治疗提高了对SL1的抑制效果，但对SL3没有额外的益处。对接分析显示，Remdesivir-TP的RdRp结合亲和力最高，ΔG值为?8.1 kcal/mol，其次是Ribavirin（?7.6 kcal/mol）和Favipiravir-TP（?7.5 kcal/mol）。Remdesivir和Favipiravir在体外对脊髓灰质炎病毒显示出显著的抗病毒效果，而Ribavirin的效果较差。然而，核苷类似物的联合使用导致了拮抗作用，这突显了在设计联合疗法时需要谨慎考虑药物的作用机制。
引言
脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae）的肠道病毒属（Enterovirus），是一种高度传染性的病毒，可导致脊髓灰质炎（Xie等人，2024年）。这种急性病毒性疾病主要影响神经系统，可能导致不可逆的瘫痪。全球脊髓灰质炎根除计划（Global Polio Eradication Initiative，GPEI）实施的措施包括常规和大规模接种灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV），以及急性弛缓性麻痹（AFP）监测系统（polioeradication, 2025a；polioeradication, 2025b）。该计划最重要的成就是在2015年和2019年分别根除了野生脊髓灰质炎病毒2型和3型（polioeradication, 2025c）。尽管在这一领域取得了显著进展，但彻底清除脊髓灰质炎病毒仍面临诸多挑战。这些挑战包括在阿富汗和巴基斯坦仍能从AFP病例中分离出野生脊髓灰质炎病毒；在初次免疫缺陷（PID）个体中，接种OPV后长期排出高度突变的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（VDPVs）；以及在疫苗接种覆盖率低的地区，由循环中的VDPVs引起的疫情（Kew等人，2005年）。目前，尚无获批用于治疗脊髓灰质炎病毒感染的抗病毒药物。虽然疫苗接种仍是GPEI工作的基础，但在面对新兴的VDPVs和免疫功能低下个体的风险时，这还不够充分。这些挑战凸显了开发有效抗病毒药物作为根除后时代补充策略和应急措施的重要性（McKinlay等人，2014年）。
依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）是治疗的关键靶点，因为它在RNA病毒复制中起着关键作用，而在宿主体内没有相应的功能性酶。因此，RdRp成为抗病毒药物开发的理想候选目标（Tian等人，2021年）。RdRp抑制剂分为两类：核苷类似物抑制剂（NIs），它们结合到活性位点；非核苷类似物抑制剂（NNIs），它们作用于别构位点（Tian等人，2021年）。NIs通过靶向病毒RdRp并阻断转录和复制而取得显著成功（Ye等人，2020年）。由于RNA病毒中的RdRp结构具有保守性，具有广谱抗病毒活性的核苷类似物抑制剂也可能对脊髓灰质炎病毒有效。其中，Ribavirin、Remdesivir和Favipiravir因其明确的作用机制和广谱抗病毒特性而最具前景。
Remdesivir（GS-5734）是一种腺苷三磷酸类似物，通过抑制多种RNA病毒的复制表现出广泛的抗病毒活性，包括埃博拉病毒（EBOV）和SARS-CoV-2（Tian等人，2021年）。Remdesivir通过诱导RNA合成链终止来抑制病毒RdRp（Tian等人，2021年；Ye等人，2020年）。尽管目前关于其对脊髓灰质炎病毒活性的证据有限，但其作用机制表明它可能是一种有前景的RdRp抑制剂。
Favipiravir（T-705）是一种嘌呤类似物前药，在细胞内转化为活性形式T-705核糖呋喃糖-5′-三磷酸（T-705-RTP）（Furuta等人，2013年）。这种活性代谢物可阻止RNA合成并抑制病毒复制。Favipiravir已被证明是多种具有RdRp的RNA病毒的有效抑制剂，无论是在体外还是体内（Furuta等人，2013年；Fang等人，2020年；Oestereich等人，2014年；Rocha-Pereira等人，2012年）。初步研究表明Favipiravir可能抑制脊髓灰质炎病毒复制，但需要进一步研究以明确其疗效（Daikoku等人，2018年）。
Ribavirin是鸟苷的类似物，通过多种机制发挥作用，包括抑制肌苷一磷酸脱氢酶（IMPDH）、直接与RdRp相互作用以及诱导致死性突变（Janowski等人，2020年；Zhou等人，2003年）。尽管Ribavirin在体外对脊髓灰质炎病毒显示出活性，但仍需进一步研究其在联合治疗中的协同效应（Crotty等人，2000年）。
除了实验方法外，最近的计算机模拟技术已成为药物发现过程中的重要工具（Freedman等人，2018年）。这些计算方法能够模拟病毒与潜在候选药物的相互作用，提供关于作用机制的见解，并有助于优化先导化合物（Singh等人，2021a，2022年）。特别是分子对接技术，已被广泛用于预测小分子如何与目标蛋白（如依赖RNA的RNA聚合酶）相互作用（Singh等人，2021b；Singh和Purohit，2024年）。
在这项研究中，我们评估并比较了Favipiravir、Ribavirin和Remdesivir在体外对类似Sabin型的脊髓灰质炎病毒1型（SL1）和3型（SL3）的抗病毒活性。我们重点研究了这些化合物对病毒复制、细胞毒性和聚合酶抑制的影响。通过使用分子对接等计算机模拟技术以及体外实验，我们提供了关于这些化合物如何与脊髓灰质炎病毒RdRp相互作用并抑制它的关键见解。由于单靠疫苗可能不足以根除脊髓灰质炎病毒，我们的发现可能有助于开发针对脊髓灰质炎病毒的靶向抗病毒疗法。
章节摘录
细胞、病毒和抗病毒药物
HeLa细胞在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS，Biowest，法国）和抗生素（青霉素：100 IU/mL；链霉素：100 μg/mL）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Sigma-Aldrich，德国）中培养。细胞在37°C、5% CO2的培养箱中维持。本研究中使用的病毒包括由荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM）提供的类似Sabin型的脊髓灰质炎病毒1型（SL1）和3型（SL3），这些病毒在HeLa细胞中繁殖。
单药治疗SL1和SL3
为了评估Remdesivir、Favipiravir和Ribavirin对类似Sabin型的脊髓灰质炎病毒1型（SL1）和3型（SL3）的抗病毒活性，将HeLa细胞感染每种病毒，并用五种不同浓度的每种药物进行处理。这些浓度是根据其他研究和我们实验室进行的广泛初步实验选定的。具体来说，文献中报告的最小和最大有效浓度被用来定义测试范围。
讨论
只有当所有脊髓灰质炎病毒的排出完全停止时，才能实现根除目标（Van Damme等人，2019年）。为此，开发有效的抗病毒药物是抗击脊髓灰质炎病毒的重要补充策略（McKinlay等人，2014年）。这类抗病毒药物对于管理免疫缺陷个体中疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（iVDPVs）的慢性排出以及通过干扰病毒复制来控制疫情至关重要。
资金来源
该项目得到了公共卫生学院和德黑兰医科大学（资助编号：1402-3-99-68223）的财政支持，并作为医学病毒学博士论文（资助编号：9921409004）的一部分进行。
CRediT作者贡献声明
帕拉斯图·索赫伊利（Parastoo Soheili）：概念构思、数据整理、正式分析、研究、验证、可视化、初稿撰写。法尔沙德·科达卡（Farshad Khodakhah）：正式分析、研究、可视化。玛丽亚姆·尤塞菲（Maryam Yousefi）：研究。赛义德·莫赫森·扎赫拉伊（Seyed Mohsen Zahraei）：资源提供。苏珊·马哈茂迪（Sussan Mahmoudi）：资源提供。穆罕默德·拉扎吉（Mohammad Razaghi）：研究。亚古布·莫拉伊（Yaghoob Mollaie）：研究。玛丽亚姆·凯万卢（Maryam Keyvanlou）：研究。艾哈迈德·内贾蒂（Ahmad Nejati）：概念构思、数据整理、研究、方法学、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢Nahaleh Naraghi博士（伊朗阿尔博兹的Actoverco制药公司）提供Remdesivir和Favipiravir；感谢Seyed Esmaeil Sadat Ebrahimi博士和Fatemeh Hajipour博士（德黑兰医科大学药学院）验证Ribavirin的纯度和熔点；同时感谢荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM）提供类似Sabin型的脊髓灰质炎病毒（SL1和SL3）。
