《World Allergy Organization Journal》：Epigenetic insights into food allergy: The potential role of DNA methylation in diagnosis and management
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表观遗传学进展为解析复杂免疫介导疾病的机制提供了关键见解。DNA甲基化是广泛存在于真核生物中的关键表观遗传修饰，是连接遗传易感性与环境暴露的重要调控枢纽。本综述概述了当前5-甲基胞嘧啶的检测方法，并系统总结了探究DNA甲基化在食物过敏中作用的相关研究。现有研究
表观遗传学进展为解析复杂免疫介导疾病的机制提供了关键见解。DNA甲基化是广泛存在于真核生物中的关键表观遗传修饰，是连接遗传易感性与环境暴露的重要调控枢纽。本综述概述了当前5-甲基胞嘧啶的检测方法，并系统总结了探究DNA甲基化在食物过敏中作用的相关研究。现有研究已考察DNA甲基化作为临床反应性、耐受性及疾病严重程度的潜在生物标志物的价值，同时明确了其在调控过敏易感性相关通路中的作用。然而，方法学异质性、样本量有限及验证流程不一致等因素仍限制了研究结果的跨研究解读。未来亟需开展大规模、标准化的研究以确证早期发现，推动其向临床实践转化。
引言
表观遗传学的发展为解析复杂疾病机制开辟了新路径。针对哮喘、过敏性鼻炎及食物过敏等特应性疾病的研究日益增多，揭示了遗传易感性、环境暴露与免疫调节之间的交互作用。本综述首先介绍DNA甲基化的基本概念及5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）检测技术，随后系统阐述DNA甲基化在食物过敏中的多重角色，包括其作为临床反应性、耐受性、疾病严重程度的标志物潜力，以及对过敏易感性的表观遗传调控作用。通过整合现有证据，本文旨在强调食物过敏表观遗传机制的新兴见解，及其对未来诊断与治疗策略的潜在影响。
DNA甲基化：概念与方法
DNA甲基化简介
DNA胞嘧啶甲基化（5mC）广泛存在于真核生物中，在正常发育及对环境刺激的反应过程中，均发挥关键的基因表达表观遗传调控作用。该过程指将甲基（–CH3）添加至DNA胞嘧啶的第5位碳原子，可在不改变DNA一级序列的前提下改变其功能（图1）。哺乳动物中，胞嘧啶甲基化主要发生在CpG二核苷酸（即DNA链中胞嘧啶C与鸟嘌呤G通过磷酸键连接的位点）。该修饰常招募参与基因抑制的蛋白，或阻碍转录因子与DNA结合，从而调控基因的沉默或表达。此外，5mC还参与逆转录转座子沉默、X染色体失活、基因组印记、维持染色体稳定性及决定细胞谱系特异性基因表达。哺乳动物中，5mC由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）建立并维持，并可被十-十一易位（ten-eleven translocation, TET）家族双加氧酶主动逆转。TET酶可将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC），该修饰不仅是主动去甲基化的中间产物，也被证实具有独立的基因调控功能。
人类体细胞中，基因组约2800万个CpG中60–80%处于甲基化状态，且甲基化CpG并非随机分布，而是富集于重复元件及基因体等区域。与之相对，启动子区域常见的高密度CpG区域被称为CpG岛，通常保持低甲基化状态，但在特定生理或病理状态下可发生甲基化。由于DNMT缺乏固有序列特异性，其如何被引导至特定基因组位点以建立情境依赖性甲基化模式，一直是表观遗传学的核心研究问题。5mC模式的异常改变与多种疾病及正常衰老密切相关。
5-甲基胞嘧啶（5mC）检测的方法学
5mC检测方法可分为“亚硫酸氢盐法”与“非亚硫酸氢盐法”。食物过敏研究中仍以1990年代初问世的亚硫酸氢盐法为主流（图2）。该方法中，未修饰胞嘧啶在低pH高温条件下与亚硫酸氢钠反应发生脱氨基，随后在高pH下去磺酸化转化为尿嘧啶；而5mC的甲基结构可保护其及衍生物5hmC免受化学反应影响。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）过程中，亚硫酸氢盐处理引入的尿嘧啶会被DNA聚合酶识别为胸腺嘧啶，而5mC及5hmC则被识别为胞嘧啶，从而实现单碱基分辨率的甲基化位点识别。
亚硫酸氢盐法存在明显局限：一是核苷酸多样性从4种降至3种，导致测序后序列比对难度显著增加；二是亚硫酸氢盐处理化学条件剧烈，会使输入的双链DNA降解为片段化的单链分子，短片段回收效率低且基因组覆盖不均，易造成信号丢失与偏倚。
为克服上述局限，“非亚硫酸氢盐法”应运而生。最具代表性的碱基分辨率方法是酶促核苷酸转化与直接测序。酶促转化技术通常利用TET酶氧化5mC及5hmC，随后由载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样（apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like, APOBEC）酶选择性地将未修饰胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，最终实现与亚硫酸氢盐法类似的区分效果。非亚硫酸氢盐法避免了DNA降解，所需输入DNA量更少，达到同等基因组覆盖所需的测序读数更低，但其依赖高活性酶促反应，转化效率易受整体甲基化水平影响，结果变异性较高。另一类无需核苷酸转化的非亚硫酸氢盐法是直接长读长DNA测序，可保留核苷酸多样性并改善基因组比对，但当前平台碱基识别准确率不足，且在DNA输入量有限时难以满足临床需求。
碱基分辨率5mC检测技术
多数碱基分辨率检测技术均基于亚硫酸氢盐或非亚硫酸氢盐转化，下游分析涵盖从单个候选位点到全基因组的多层次策略。
全基因组分析方法旨在覆盖整个基因组的甲基化状态。全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）成本极高，因DNA降解及比对困难，单样本常需数亿条测序读数。针对游离DNA、福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）DNA等低输入或损伤样本，已开发更温和、快速的亚硫酸氢盐化学试剂与替代工作流程，以减少DNA损伤并提升低丰度片段的回收率。直接长读长测序（如Oxford Nanopore Technologies的纳米孔测序与Pacific Biosciences的PacBio测序）无需核苷酸转化即可直接检测5mC及其他修饰碱基，还可实现甲基化定相（即确定同一条DNA链上的共甲基化模式），但目前仍存在碱基识别精度有限、DNA输入要求高等瓶颈，限制了临床应用。
靶向富集方法仅聚焦于已知甲基化位点，是更具性价比的选择。这类检测利用商业化或定制化探针panel，选择性分析预定义的甲基化位点，通常包含三步：通过核苷酸转化（亚硫酸氢盐或非亚硫酸氢盐法）区分甲基化与未甲基化胞嘧啶；与能够识别DNA序列甲基化状态的寡核苷酸探针杂交；通过测序工作流进行检测与定量。食物过敏研究中最常用的平台是Illumina Infinium HumanMethylation 450 BeadChip（450K芯片），可检测约48.5万个CpG位点；其升级版Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip（EPIC芯片）覆盖约85万个已知CpG位点，虽仅占基因组所有CpG的约3.5%，却覆盖了约99%共识基因的启动子、第一外显子等区域及多数已知增强子。Twist Bioscience的人类甲基化组panel是新兴的大规模靶向富集方法，覆盖基因组中约350万个已知胞嘧啶甲基化位点，聚焦于CpG岛、增强子等调控区域，采用液相杂交捕获而非芯片固相杂交，灵活性更高且定量更直接，但尚未经过广泛验证。
单/多位点检测方法适用于小规模分析。焦磷酸测序是稳健且常用的技术，可对单个或少量基因组位点的甲基化状态进行定量：经核苷酸转化后，靶向区域经PCR扩增，测序过程中DNA聚合酶逐个掺入修饰碱基并释放光信号，可实现碱基水平的甲基化定量，灵敏度与准确性优于甲基化特异性qPCR。
表观基因组-wide与候选基因研究策略
DNA甲基化研究可分为无假设的表观基因组-wide研究与有假设的候选基因研究（表1）。前者（如使用450K芯片）无先验位点假设，可扫描全基因组数十万CpG位点，适合发现新关联；后者聚焦已有证据支持的疾病相关特定基因，适合针对性验证。表观基因组-wide研究适合机制探索，候选基因研究则更适合样本量有限的验证性工作。本综述纳入的研究中，前者包括Martino等、Hong等、Petrus等、Imran等、Do等、López-Gómez等的多项研究，后者包括Zhou等、Syed等、Berni Canani等的多项研究。
食物过敏中的DNA甲基化研究
食物过敏诊断的表观遗传学研究
当前食物过敏检测主要依赖皮肤点刺试验（skin prick test, SPT）与血清过敏原特异性IgE（specific IgE, sIgE）检测，二者仅能反映致敏状态，无法确诊临床过敏，假阳性率高，金标准仍是口服食物激发试验（oral food challenge, OFC）。多项研究评估了DNA甲基化作为诊断生物标志物的性能。Martino等采用450K芯片对花生或鸡蛋过敏婴儿的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）进行表观基因组-wide分析，鉴定出由96个CpG位点组成的甲基化特征，可预测OFC结果，且预测效能优于sIgE与SPT，该特征在独立队列的CD4+T细胞中仍保持准确性，富集通路为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路。Zhou等采用靶向亚硫酸氢盐测序分析花生过敏儿童PBMCs，发现12个基因的CpG甲基化水平存在显著差异，其中CXCL12、BDNF与CD3ε或SERPINE1的组合可区分过敏与非过敏个体，曲线下面积（area under the curve, AUC）达0.97–0.98，显著优于sIgE的0.85。Hong等对牛奶过敏儿童全血进行表观基因组-wide分析，鉴定出575个差异甲基化位点，多数在病例中呈低甲基化，复制验证了8个位点，注释基因涉及Th1/Th2通路及NDFIP2等新基因。Petrus等在荷兰队列中发现牛奶过敏儿童整体呈高甲基化，但未发现达到全基因组显著性的单个CpG，部分验证了DHX58等4个基因的差异甲基化。Imran等对纯化B细胞进行分析，鉴定出区分过敏与非过敏的差异甲基化探针与差异表达基因，并发现单食物过敏与多食物过敏的表观遗传差异，但DNA甲基化与转录活性的一致性较低。
食物过敏反应严重程度的表观遗传学视角
即使SPT与sIgE水平相似，个体的临床反应严重程度也存在显著差异，其机制尚不明确。Do等在双盲安慰剂对照OFC过程中采集花生过敏儿童的样本，整合分析CD4+T细胞DNA甲基化与全血基因表达，鉴定出203个与反应严重程度相关的CpG位点及318个差异表达基因，富集于一氧化氮调节、巨噬细胞活化等生物学过程，因果中介分析显示PHACTR1与ZNF121的表达介导了对应CpG甲基化与反应严重程度之间的关联。
获得耐受的表观遗传学研究
口服免疫治疗（oral immunotherapy, OIT）与饮食调整等干预措施可影响DNA甲基化模式。Syed等发现花生过敏患者接受24个月OIT后，获得免疫耐受者的抗原诱导调节性T细胞（antigen-induced regulatory T cells, ai-Tregs）中FOXP3基因甲基化水平显著低于非耐受者与回避治疗者，且停止治疗后复发的个体FOXP3甲基化水平回升。Berni Canani等发现活动期牛奶过敏儿童的PBMCs中，Th2细胞因子基因IL-4、IL-5呈低甲基化，Th1细胞因子基因IL-10、IFN-γ呈高甲基化，获得耐受者的甲基化谱与活动期及健康对照均不同，且接受含鼠李糖乳杆菌GG的深度水解酪蛋白配方患儿的细胞因子甲基化模式与其他配方组存在差异。López-Gómez等发现IgE介导与非IgE介导牛奶过敏存在不同的差异甲基化区域，6个月牛奶回避后获得耐受的婴儿发生了广泛的甲基化变化。上述研究表明，免疫耐受的获得伴随特征性DNA甲基化改变，且受治疗与饮食干预的动态调控。
食物过敏遗传易感性的表观遗传介导机制
Hong等整合遗传与表观遗传数据，发现6p21.32区域HLA-DR与HLA-DQ基因区的rs7192与rs9275596两个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）与花生过敏相关，且在73例花生过敏与67例对照的子集中，这些SNPs与HLA-DRB5、HLA-DRB1、HLA-DQB1等基因区域内18个CpG位点的甲基化水平相关，因果推断分析提示HLA-DRB1与HLA-DQB1区域内的CpG甲基化部分介导了这些SNPs对花生过敏风险的影响，这是首个证明DNA甲基化可介导HLA区域遗传变异增加花生过敏易感性的证据。
讨论
现有研究揭示了DNA甲基化在食物过敏临床反应性、耐受性、疾病严重程度及遗传易感性中的重要作用，两项研究证实其诊断效能优于传统工具。但不同研究的差异甲基化特征重叠度低，可能源于样本类型异质性（PBMCs、T细胞、B细胞、全血的细胞组成差异）、样本量偏小、研究对象年龄与地域差异、表型定义标准不一、检测平台（450K芯片与EPIC芯片）覆盖范围与分析流程不同等多重因素。多数研究未在独立队列中验证发现，限制了结果的可靠性。未来需建立标准化的受试者招募、表型定义与样本处理流程，开展大样本纵向队列研究，并结合多组学数据，明确DNA甲基化作为辅助临床诊断、疾病分层与风险预测的潜在价值，在充分验证与标准化后方可考虑临床转化。
结论
测序技术的进步为解析食物过敏的分子机制提供了新机遇。尽管该领域仍处于早期阶段，但通过解决方法学异质性与加强验证策略，有望将这些发现转化为更精准的诊断与个体化治疗方案。
