配对DNA与RNA测序揭示调控人类视网膜基因表达的常见与罕见变异

《Nature Communications》：Paired DNA and RNA sequencing uncovers common and rare variation regulating human retinal gene expression

影响视力的遗传性疾病在全球范围内累及数百万人群，包括常见病变如年龄相关性黄斑变性(AMD)及罕见病变如遗传性视网膜病(IRD)。目前，关于遗传变异对人类视网膜基因表达的影响及其在疾病发生中的作用仍缺乏系统性认识。研究人员通过对201例死后眼组织的全基因组测序与批量RNA测序，构建了神经感觉视网膜(NSR)与视网膜色素上皮(RPE)的基因表达与遗传变异关联图谱。研究发现，共鉴定出1483595个显著的顺式表达数量性状位点(cis-eQTL)，分别调控NSR中9959个基因与RPE中3699个基因，这些遗传变异富集于顺式候选调控元件(cCRE)，并在两种组织间共享大量eGenes。此外，研究检测到1051个表达离群事件，并优先筛选出299个罕见非编码单核苷酸变异、结构变异或拷贝数变异，作为28%离群事件的潜在驱动因素。该研究显著提升了人类视网膜基因表达调控机制的理解。

本研究由研究人员发表于《Nature Communications》，针对视力相关遗传病发病机制中遗传变异对视网膜基因表达调控认知不足的问题展开。视网膜作为高度特化的光感受器组织，其神经元与非神经元细胞类型的相互作用异常会导致AMD及多种IRD，但这些疾病的遗传基础仍待深入解析。现有GTEx项目未涵盖眼科组织，已有视网膜eQTL研究多局限于常见单核苷酸变异，缺乏对罕见变异、结构变异及拷贝数变异的系统分析。为此，研究人员构建了来自曼彻斯特眼组织库(METR)的201例无晚期AMD及单基因眼病的欧洲遗传背景供体队列，整合全基因组测序与批量RNA测序数据，系统绘制了NSR与RPE的遗传-转录组图谱，并首次在视网膜中实现了对罕见变异驱动表达离群事件的机制探索。

关键技术方法方面，研究采用Illumina NovaSeq6000平台进行短读长全基因组测序(平均覆盖深度35.9×)与polyA富集RNA测序，使用DRAGEN软件完成比对与变异检测，GENCODE v38注释进行基因定量。通过tensorQTL进行cis-eQTL定位，结合DROP流程识别表达离群值，并采用分层筛选框架与Watershed概率模型优先候选罕见变异，最后通过双荧光素酶报告实验验证功能性非编码变异。队列样本均来自经伦理批准的METR生物样本库，包含183例NSR与176例RPE的高质量转录组数据。

研究结果分为以下部分：

METR基因组-转录组资源整合201例死后眼样本的基因组与视网膜转录组数据

研究人员建立了包含201例无关个体的METR队列，中位年龄71岁，均为欧洲遗传背景。质量控制显示NSR样本RNA完整性数值(RIN)中位数为7.9，RPE为6.9，平均唯一比对率分别为89.4%与82.9%。差异表达分析鉴定出14957个NSR与RPE间的差异基因，细胞类型反卷积证实样本代表性符合组织特征。

METR eQTL提供影响已知眼病相关基因的非编码变异新见解

在NSR与RPE中分别鉴定出1424946与465045个显著cis-eQTL，其中406396个为两组织共有。与EyeGEx及Strunz等既往视网膜eQTL数据集相比，本研究复制了62%的NSR eGenes，并新发现3778个此前未报道的eGenes，同时验证了13个与AMD风险相关的已知eQTL。

超过800个eGenes在NSR与RPE中新被发现

与GTEx非眼组织数据比较，研究新发现337424个METR-eQTL与916个eGenes，其中479个为新lncRNA，5个为已知单基因眼病相关基因。eQTL相似度最高的GTEx组织为脑皮层(IoU=0.28)。

驱动表达谱差异的遗传变异富集于候选顺式调控元件(cCRE)

eVariants显著富集于启动子与近端增强子区域，且在视网膜特异性cCRE中富集程度最高，尤其在视杆与视锥细胞的开放染色质区域。仅11.8%的eVariants与已注释cCRE重叠。

METR-eQTL特性在已知单基因病基因与非病基因间存在差异

已知眼病基因的eQTL效应值更低、等位基因频率更高，且每个基因关联的eVariants数量更少，表达变异性更低，提示这类基因的表达调控更为严格。

罕见变异是NSR与RPE转录组离群值的潜在驱动因素

共鉴定1051个表达离群事件，分层筛选与Watershed模型分别优先出528与135个候选罕见变异驱动事件，包括结构变异、拷贝数变异及非编码单核苷酸变异，并通过双荧光素酶实验验证了CAND2启动子区罕见变异对基因表达的抑制作用。

讨论部分指出，该研究首次将全基因组测序与高深度RNA测序结合应用于NSR与RPE，克服了既往研究无法系统分析罕见变异的局限。在无晚期AMD的队列中复制了既往eQTL发现，并揭示了眼病基因eQTL的独特属性。研究发现的罕见非编码变异驱动表达离群的机制，为解析AMD与IRD的发病机理提供了新视角，并为未来多组学整合分析与临床诊断提供了重要资源。