《OncoImmunology》：An orthotopic organoid-based model to study early CD8? T cell dysfunction and immunotherapy response in colorectal cancer
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结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）治疗是当前临床重大挑战，免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor, ICI）仅对少数患者产生持久应答。深入解析CD8? T细胞耗竭及其对ICI应答的贡献，对开发更有效治疗策
结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）治疗是当前临床重大挑战，免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor, ICI）仅对少数患者产生持久应答。深入解析CD8? T细胞耗竭及其对ICI应答的贡献，对开发更有效治疗策略至关重要。因此，能够真实复现人类CRC免疫特征的临床前模型是解决上述问题的关键。研究人员建立了同源类器官源性原位CRC小鼠模型，将携带Apc-/-KrasG12D/+Trp53R172H/-Smad4-/-（AKPS）四重突变的肠道类器官移植至免疫健全小鼠直肠黏膜下层。单细胞转录组学分析显示，CD8? T细胞是肿瘤浸润白细胞的主要群体，包含向功能异常状态过渡的亚群。功能实验表明，清除CD8? T细胞会导致原位AKPS移植物肿瘤负荷增加，证实其抗肿瘤活性。重要的是，抗PD-1治疗增加了AKPS肿瘤内功能异常CD8? T细胞群体的丰度并抑制肿瘤生长，证明该模型对ICI具有应答性。相比之下，皮下植入的AKPS肿瘤浸润混合CD4?和CD8? T细胞亚群，且CD8? T细胞耗竭特征显著减弱，凸显了异位肿瘤模型在研究抗肿瘤免疫反应方面的局限性。综上，AKPS原位CRC模型可作为解析CD8? T细胞早期功能异常的分子机制及临床前评估新型CRC免疫治疗干预的平台。
本研究发表于《OncoImmunology》，针对结直肠癌免疫治疗应答率低、缺乏能精准模拟人类肿瘤免疫微环境的临床前模型的现状展开。目前免疫检查点抑制剂仅对约10%具有高微卫星不稳定性（Microsatellite instability, MSI）和错配修复缺陷（Mismatch repair deficiency, MMRd）的结直肠癌患者有效，而占多数的微卫星稳定（Microsatellite stable, MSS）型患者缺乏有效治疗方案，其核心瓶颈在于对CD8? T细胞耗竭机制的解析不足，且现有模型无法复现肿瘤原位免疫特征。为此，研究人员构建了携带Apc、Kras、Trp53、Smad4四重常见驱动突变的AKPS肠道类器官原位移植模型，旨在解析CD8? T细胞早期功能异常的分子机制，并验证其作为免疫治疗临床前平台的适用性。
研究采用的关键技术方法包括：利用基因工程小鼠来源的AKPS四重突变肠道类器官，分别进行直肠黏膜下层原位移植和右侧 flank 皮下移植构建同基因型肿瘤模型；采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）的转录组异质性；通过流式细胞术（Flow cytometry）分选及功能检测分析CD8? T细胞的表型与功能；设置CD8? T细胞清除实验和抗PD-1阻断治疗实验验证免疫应答；整合公共人类结直肠癌单细胞数据集（GSE178341）进行跨物种免疫特征比对。
研究结果如下：
一种基于AKPS四重突变肠道类器官原位移植的高效结直肠癌小鼠模型
研究人员将经Cre重组酶诱导获得Apc-/-KrasG12D/+Trp53R172H/-Smad4-/-基因型、表达肠上皮标志物及连接蛋白的AKPS类器官移植至C57BL/6J小鼠直肠黏膜下层，移植后1周即可形成局限腺癌，成功建立可快速成瘤、遗传背景明确且解剖位置生理的原位结直肠癌模型。
单细胞转录组分析揭示AKPS肿瘤浸润淋巴细胞中CD8? T细胞簇富集
对6例AKPS肿瘤浸润CD45?淋巴细胞进行单细胞测序，共鉴定出14个免疫细胞簇，其中T细胞占比最高，包含7个CD8? T细胞簇、2个CD4? T细胞簇及2个γδ T细胞簇，CD8? T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞的最主要组成。
AKPS肿瘤浸润CD8? T细胞的功能异质性
转录组分析显示，AKPS肿瘤内CD8? T细胞呈现耗竭特征：CD8b与CD8f簇高表达Tcf7（编码TCF1）、Pdcd1（PD-1）及Slamf6，符合祖细胞耗竭T细胞（Progenitor exhausted T cells, Tpex）特征；CD8d簇高表达Ⅰ型干扰素刺激基因；CD8e簇高表达增殖相关基因及中间态耗竭特征；CD8a、CD8c、CD8g簇高表达终末耗竭标志物（如Gzmk、Cx3cr1、Ctla4、Lag3、Havcr2/TIM-3等）。拟时序分析进一步验证了从Tpex向终末耗竭T细胞（Terminally exhausted T cells, Tex）的分化轨迹。
原位AKPS肿瘤浸润CD8? T细胞的表型与功能分析
免疫荧光与流式细胞术验证，AKPS肿瘤内CD8? T细胞大量浸润，以效应表型（CD44?CD62L?）为主，同时高表达PD-1、TIM-3、NKG2A、CD94等抑制受体，TCF1表达缺失。功能实验显示，清除CD8? T细胞显著增加肿瘤负荷；体外再刺激实验中，肿瘤浸润CD8? T细胞的TNF-α分泌能力较脾脏CD8? T细胞显著降低，而IFN-γ分泌无显著差异，提示其呈现选择性功能缺陷。
肿瘤微环境与突变负荷塑造CD8? T细胞表型多样性
对比研究发现，皮下移植的AKPS肿瘤中CD4?与CD8? T细胞比例相当，耗竭CD8? T细胞占比极低；同为原位移植的MC38模型虽T细胞浸润总量与AKPS相当，但CD4?/CD8?比例均衡，且CD8? T细胞耗竭程度更低。跨物种比对显示，AKPS模型的CD8? T细胞特征与人类MMRp（MSS型）结直肠癌的免疫特征高度相似。
AKPS模型作为评估抗PD-1免疫治疗应答的临床前平台
抗PD-1治疗显著抑制AKPS肿瘤生长，同时增加肿瘤内TCF1?CD8? T细胞中TIM-3?、CXCR6?及增殖标记Ki-67的表达，证实PD-1阻断可促进Tpex向新生Tex分化，重振抗肿瘤免疫应答。
讨论部分指出，AKPS原位类器官模型兼具遗传保真度与解剖生理相关性，克服了传统细胞系模型与原位微环境脱节的局限。其核心优势在于完整保留了MSS型结直肠癌的CD8? T细胞耗竭连续谱，尤其是富含Tpex亚群，可作为解析早期T细胞功能异常机制及筛选新型免疫联合疗法的可靠平台。研究同时提示，肿瘤解剖位置与遗传背景共同决定免疫微环境特征，跨模型结论外推需谨慎。该研究为MSS型结直肠癌的免疫治疗转化提供了关键的临床前证据，也为后续解析肿瘤代谢与信号通路调控T细胞耗竭的机制奠定了基础。
