通过从PCR或LAMP产物中转录crRNA来实现CRISPR-Cas12a生物传感，用于病原体检测

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR-Cas12a biosensing via transcription of crRNA from PCR or LAMP products for pathogen detection

帕特里克·瓦卡巴（Patrick Wakaba）|村松昭（Akira Muramatsu）|今川敏文（Toshifumi Imagawa）|古濑由纪（Yuki Furuse）|齐藤信夫（Nobuo Saito）|宇野直树（Naoki Uno）

长崎大学热带医学与全球健康学院，日本长崎852-8523

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白12a（Cas12a）是一种由RNA引导的核酸酶，已被用于基于核酸的分子诊断。然而，基于Cas12的分子诊断方法的广泛应用受到限制，因为其激活需要目标双链DNA（dsDNA）中存在一个特定的原间隔序列（PAM）。为了消除对PAM的依赖，我们设计了一种非传统的激活方式，通过使用带尾引物进行PCR扩增，从而从扩增的目标dsDNA产物中转录出crRNA。然后，这种转录的crRNA与dsDNA激活剂共同激活Cas12a。我们验证了这种方法，并将其命名为PCR后接Transcription And CRISPR-Cas12a（PCR-TRAC）。随后，我们又开发了基于环介导等温扩增（LAMP）的PCR-TRAC方法。这两种方法都能检测到从临床样本中提取的结核分枝杆菌基因组DNA。LAMP-TRAC比PCR-TRAC更灵敏、更快，能够在1小时内检测到低至每微升4个结核分枝杆菌基因组DNA拷贝。我们设想，基于CRISPR-Cas12的诊断方法可以扩展为一个通用平台，用于识别各种其他核酸目标。

引言

CRISPR-Cas12a系统是分子诊断领域中非常有效的工具，尤其是在传染病研究方面。CRISPR-Cas12a利用CRISPR RNA（crRNA）来探测并结合目标DNA序列，从而激活CRISPR-Cas12a核酸酶的活性。具体来说，除了靶向顺式切割外，Cas12a的激活还会导致非靶向的反式切割邻近的单链DNA（ssDNA）；因此，一个短的ssDNA-FQ报告基因可以作为荧光读数（Chen等人，2018年；Li等人，2019年）。通过结合目标扩增和Cas12a，已经进行了大量研究以实现高灵敏度的病原体核酸检测（Chen等人，2018年；Freije和Sabeti，2021年；Habimana等人，2022年；Wang等人，2020年）。然而，现有的基于CRISPR-Cas12的检测策略仍存在一些限制。其主要缺点是依赖于目标双链DNA（dsDNA）中的PAM序列来激活Cas12a，这使得针对没有PAM的dsDNA序列变得困难（Chen等人，2018年；Zetsche等人，2015年）。由于绝大多数dsDNA序列缺乏PAM，因此一种无需PAM的CRISPR-Cas12检测策略将具有优势，能够通用地检测各种dsDNA序列（Karlikow等人，2023年；Zhu等人，2025年）。为了解决这个问题，主要设计了基于生成目标ssDNA的策略，因为对于ssDNA目标来说，PAM序列并不是必需的。例如，如果重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR-Cas12a反应在同一溶液中同时进行，即使目标序列没有PAM也可以使用，因为在聚合过程中会生成目标ssDNA（Ding等人，2020年）。然而，允许RPA和CRISPR-Cas12a反应在同一溶液中进行的条件非常有限，且不利于两种反应的进行。另一种生成ssDNA的方法是基于不对称RPA的，但这种方法的目标扩增和ssDNA生成效率较低（Cao等人，2023年；Yang等人，2024年）。ssDNA也可以通过物理化学方法（Ai等人，2025年）、链置换（Meng等人，2024年）或限制性内切酶（Huang等人，2025年）从dsDNA扩增子中高效生成，但这些方法需要额外的步骤，从而使检测过程复杂且耗时。此外，研究表明，Cas12a核酸酶的活性很少受到ssDNA错配的影响（Chen等人，2018年；Ooi等人，2021年；Zhang等人，2024年），这可能会在使用ssDNA激活Cas12a时导致特异性问题。因此，基于ssDNA生成的无PAM策略的局限性日益明显。

虽然许多关于无PAM CRISPR-Cas12a系统的研究依赖于生成ssDNA目标，但也有报道指出可以在PCR或LAMP产物中引入PAM序列（Chen等人，2021年；Zhu等人，2022年）。然而，这种策略的特异性较低，因为crRNA可能会与非特异性产物结合。此外，基于CRISPR-Cas12的检测设计在选择高效crRNA时也存在困难。crRNA的设计和性能很大程度上取决于目标DNA序列，即使目标序列有微小变化也会显著影响Cas12a的切割效率（Ooi等人，2021年）。因此，实验验证高效crRNA的过程通常既昂贵又耗时。crRNA还容易受到RN酶的降解，在长期储存过程中可能会失去稳定性，从而降低检测的可靠性和性能。为了解决这些问题，最近的研究提出了一种非传统的CRISPR-Cas12a激活模式，即先从扩增子中转录crRNA，然后再与专门为该crRNA设计的dsDNA激活剂结合（Tian等人，2020年使用滚环扩增法验证）；然而，这些方法主要针对短单链核酸（如microRNA），限制了其在CRISPR-Cas12应用中的广泛使用。因此，开发一种不依赖于PAM的CRISPR-Cas12检测方法至关重要，该方法应能够不受扩增目标DNA序列的影响，同时保持高靶向效率和抗降解性。

在这里，我们采用了一种非传统的激活模式来消除dsDNA目标对PAM的依赖。通过使用带尾引物，我们生成了含有T7启动子的扩增产物和crRNA序列。随后的转录产生了crRNA，它在dsDNA激活剂的存在下激活Cas12a。如上所述，扩增目标dsDNA序列的选择不受PAM序列的限制，因为crRNA不与扩增目标dsDNA结合，而是与含有PAM序列的dsDNA激活剂结合。这意味着crRNA和dsDNA激活器的设计可以独立于扩增目标序列。该工作流程与传统CRISPR-Cas12系统一样简单，因为在目标扩增后，crRNA的转录和CRISPR-Cas12反应会同时发生。我们开发了两种不依赖于PAM的CRISPR-Cas12方法，分别称为聚合酶链反应（PCR后接Transcription And CRISPR-Cas12a（PCR-TRAC）和环介导等温扩增（LAMP）后接Transcription And CRISPR-Cas12a（LAMP-TRAC）。这两种方法都是为了检测结核分枝杆菌 DNA而设计的。

章节片段

寡核苷酸设计

使用Primer3软件设计了针对结核分枝杆菌 IS1081序列的正向和反向引物（https://primer3.org/）。dsDNA激活剂序列来自之前的研究（Yao等人，2020年），但在此进行了修改，加入了PAM序列。dsDNA激活剂是通过在95°C下杂交互补的ssDNA链并使用PCR Thermal Cycler Dice TP600（Takara，日本）逐步冷却制备的。crRNA序列的设计基于dsDNA激活剂序列。

通过PCR产物转录的crRNA触发CRISPR-Cas12a模式

首先，我们设计了一种基于从PCR扩增子中合成crRNA的非传统CRISPR-Cas12系统。设计了针对结核分枝杆菌 IS1081序列的特异性引物。正向和反向引物分别带有T7启动子和crRNA互补序列（图1A）。PCR完成后，转录和CRISPR-Cas12a反应同时进行，期间crRNA从PCR产物中转录并与其dsDNA激活剂结合

结论

我们开发了两种基于CRISPR-Cas12的检测方法（PCR-TRAC和LAMP-TRAC），用于检测结核分枝杆菌 DNA，这两种方法都基于从扩增子中转录crRNA。我们设计了不同的引物组合，包括crRNA引物，以从PCR产物中转录crRNA，并确定了最有效的引物组合，包括带尾的正向引物、无尾的反向引物和crRNA引物。PCR-TRAC和LAMP-TRAC都允许我们选择目标序列

CRediT作者贡献声明

齐藤信夫（Nobuo Saito）：监督、资金获取。古濑由纪（Yuki Furuse）：撰写 – 审稿与编辑。宇野直树（Naoki Uno）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、监督、资源管理、方法论、概念化。帕特里克·瓦卡巴（Patrick Wakaba）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法论、研究、数据分析、概念化。今川敏文（Toshifumi Imagawa）：撰写 – 审稿与编辑。村松昭（Akira Muramatsu）：撰写 – 审稿与

Hou等人，2010年。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

资助

本工作得到了SHIONOGI传染病研究促进基金会的支持。

作者声明没有竞争性利益。