使用便携式多管设备中的单管RPA辅助CRISPR-Cas12a/Cas13a检测方法，快速多重检测棘球蚴（Echinococcus granulosus）和多房棘球蚴（Echinococcus multilocularis）

《Biosensors and Bioelectronics》：Rapid multiplex detection of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis using a one-pot RPA-assisted CRISPR-Cas12a/Cas13a assay in a portable multi-tube device

董子健|刘叶辉|吴晓霞|班万里|赵莉|刘小蕾|丁静

中国吉林大学动物医学学院人畜共患病研究所，教育部人畜共患病重点实验室，严重人畜共患病诊断与治疗国家重点实验室，长春130062

摘要

由Echinococcus granulosus和Echinococcus multilocularis引起的包虫病仍然是一个重要的人畜共患病威胁，尤其是在牧区，这些地区需要快速的环境监测，但技术条件有限。在这里，我们报告了一种快速且集成的一锅法重组酶聚合酶扩增辅助的、正交的CRISPR-Cas12a/Cas13a平台，用于在环境样本中快速且特异性地区分这两种物种。结合简化的基于NaOH的DNA提取方法，该检测方法可以在60分钟内完成，检测限低至1个拷贝/μL，并且没有明显的交叉反应。为了便于现场应用，我们进一步开发了一种低成本、微型化的手持设备，能够同时分析多达八个样本，并具有双目标读数功能。该平台使用现场样本进行了验证，包括犬粪便、牧草和蔬菜，结果显示与定量PCR结果完全一致，灵敏度和特异性均为100%。这种基于CRISPR的生物传感系统为现场包虫病监测提供了一种稳健且可部署的解决方案，并为多重环境病原体检测提供了一个可扩展的框架。

引言

由Echinococcus属绦虫引起的包虫病仍然是一个全球重要的人畜共患病，对健康和社会经济造成了重大负担（Otero-Abad和Torgerson 2013）。两种主要形式，囊性包虫病（CE）和肺泡性包虫病（AE），分别由Echinococcus granulosus（E. granulosus）和Echinococcus multilocularis（E. multilocularis）引起（McManus等人2003）。尽管采取了持续的控制措施，全球负担仍然很大，估计的伤残调整生命年（DALYs）为CE 285,500年（考虑到报告不足的情况超过100万），AE为666,434年（Torgerson等人2010；Wen等人2019）。此外，牲畜感染还会导致重大经济损失，特别是在流行地区（Budke等人2006）。人类感染是通过摄入来自犬粪便或受污染的环境基质（如土壤、牧草、水和新鲜农产品）中的寄生虫卵而发生的，这突显了环境在疾病传播中的关键作用（Barosi和Umhang 2024；Possenti等人2016；Zhang等人2022b）。因此，对环境样本中Echinococcus属的敏感、快速和可现场部署的检测对于有效的监测和控制至关重要。

现有的检测策略，包括免疫测定和核酸扩增测试（NAATs），在分散部署方面面临挑战（Avila等人；Cai等人2024；Dinkel等人；Knapp等人2014；Morel等人2013；Shang等人2019；Wang等人2021；Wassermann等人）。像copro-ELISA这样的免疫测定可以实现高通量筛查，但可能表现出有限的灵敏度和特异性（Morel等人2013；Wang等人2021）。尽管基于PCR和qPCR的检测方法提供了高分析性能，但它们依赖于热循环、专用仪器和受过培训的人员，这限制了它们在资源有限环境中的适用性（Dinkel等人；Knapp等人2014；Knapp等人；Shang等人2019）。等温扩增方法（如LAMP和RPA）部分解决了这些限制；然而，它们的高扩增效率可能会增加气溶胶污染和假阳性结果的风险，这可能会影响现场条件下的可靠性（Aman等人；Avila等人；Cai等人2024；Wassermann等人）。

为了解决这些挑战，人们正在探索具有更高灵敏度、特异性和操作简便性的替代分子诊断方法。基于CRISPR的诊断方法最近作为一种强大的核酸检测方法出现，通过旁路切割活性提供可编程的特异性和信号放大（Abudayyeh等人2017；Chen等人2018；Gootenberg等人；Kellner等人2019）。特别是基于Cas12a和Cas13a的系统在病原体检测和环境监测中表现出稳健的性能（Shao等人2024）。然而，目前的基于CRISPR的包虫病检测方法主要限于单目标检测，这不足以区分共流行的Echinococcus物种（Ma等人；Shao等人2024）。整合Cas12a和Cas13a的正交CRISPR系统由于其不同的底物特异性和切割机制，为多重检测提供了一个有吸引力的框架（Jiang等人2023；Liu等人2023；Tan等人2024；Tian等人2022）。

尽管有这种潜力，多重CRISPR诊断的实际应用仍然受到信号串扰、工作流程复杂性和依赖实验室荧光仪器的限制（Tian等人2022）。侧向流动读数提高了便携性，但通常以牺牲分析灵敏度为代价（Zhang等人2024；Zhu等人）。微流控集成实现了更高水平的多重检测；然而，它通常会增加系统成本和操作复杂性，限制了现场部署的可扩展性（Ackerman等人2020；Bruch等人2021）。智能手机辅助的平台提供了部分检测的 decentralization；然而，成像硬件和数据处理工作流程的变异性限制了可重复性和跨平台标准化（Hu等人2025；Zhang等人2022a）。总的来说，这些限制突显了对一个稳健、标准化和可现场部署的多重检测平台的关键需求。

在这里，我们报告了一个一锅法双基因检测平台，它整合了CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a的正交切割活性，用于同时识别E. granulosus和E. multilocularis。为了解决传统读数系统的限制，我们进一步开发了一个独立的便携设备，标准化了光学信号采集和数据处理，从而实现了可重复且与仪器无关的检测。该平台实现了多重分析，并具有可视化读数和标准化的强度量化。它表现出高分析灵敏度和特异性，没有明显的交叉反应，其性能已使用现场相关样本进行了验证。检测工作流程和设备配置的概述见图1。总的来说，这个集成系统为现场监测提供了一个实用且可部署的解决方案。

章节片段

试剂

手稿中的所有实验试剂都在支持信息中详细说明。引物、crRNA和探针由Sangon Biotech Co., Ltd合成，并列在表S1中。

RPA扩增和CRISPR-Cas检测

RPA检测是按照制造商的说明使用TwistAmp? Basic试剂盒进行的。RPA反应包括15 μL的RPA缓冲液、0.5 μM的正向和反向引物、10⁵拷贝的模板、280 mM的醋酸镁，以及加入25 μL的无核酸酶水。反应在

基于CRISPR的核酸检测利用可编程的目标识别和旁路切割活性，在等温条件下生成放大的荧光信号。当与特定核酸序列结合时，激活的Cas核酸酶非特异性地切割标记的报告分子，从而实现高灵敏度和特异性检测（Abudayyeh等人2017；Chen等人2018）。这些特性使得CRISPR系统特别适合快速和现场部署

结论

在这项研究中，开发了一种便携式的RPA辅助CRISPR–Cas12a/Cas13a平台，用于同时检测E. granulosus和E. multilocularis。与传统方法（如qPCR）相比，该系统能够在等温条件下在60分钟内实现快速检测，同时保持相当的灵敏度。该检测方法的检测限为1个拷贝/μL，并表现出高物种特异性，没有交叉反应。这种特异性归因于

董子健：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，软件，概念化。刘叶辉：撰写 – 原稿，正式分析，数据管理，概念化。刘小蕾：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，正式分析，概念化。丁静：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，项目管理，正式分析，数据管理，概念化。吴晓霞：验证，监督，

Aman等人；Avila等人；Dinkel等人；Gootenberg等人；Ma等人；Wassermann等人；Zhu等人。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了中国国家重点研发计划（2023YFD1801000）和吉林省的科技发展计划项目（SKL202502005JC）的支持。