《Chinese Medicine》：Epigenetic precision diagnostics of traditional Chinese medicine (TCM) syndrome differentiation: a pilot study of atrial fibrillation with qi-yin deficiency syndrome based on 5-hydroxymethylcytosine signatures in extracellular vesicle DNA from plasma
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传统中医（Traditional Chinese Medicine, TCM）辨证是临床实践的核心环节，直接决定药物治疗的有效性。然而，基于代谢物、蛋白质等生物标志物构建的TCM证候精准诊断模型始终难以实现高精度。近期研究表明TCM与表观遗传学存在密切联系，但
传统中医（Traditional Chinese Medicine, TCM）辨证是临床实践的核心环节，直接决定药物治疗的有效性。然而，基于代谢物、蛋白质等生物标志物构建的TCM证候精准诊断模型始终难以实现高精度。近期研究表明TCM与表观遗传学存在密切联系，但该领域在TCM诊断中仍待深入探索。研究人员以心房颤动（Atrial Fibrillation, AF）合并气阴两虚证（Qi-Yin Deficiency Syndrome, QYDS）为例，采用名为5hmC-Seal的表观遗传测序技术，结合多种机器学习模型，开发用于识别表观遗传生物标志物的“表观遗传差异证候（Epigenetic Differential Syndrome, Epi-DS）”技术。该方法对构建更精准的TCM证候诊断模型及推动TCM现代化至关重要。研究人员开展了一项单中心前瞻性研究，纳入AF的QYDS与非气阴两虚证（Non-Qi-Yin Deficiency Syndrome, NQYDS）两个独立队列（队列1和队列2），利用5hmC-Seal获取患者血浆细胞外囊泡DNA（extracellular vesicle DNA, evDNA）的全基因组5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC）图谱。随后在训练集、验证集和外部队列三个数据集上应用多种机器学习算法构建并验证QYDS诊断模型。基于AF患者QYDS的羟甲基化图谱，研究人员成功构建了AF的疾病-表型-分子生物学网络。在分子层面鉴定出9个AF合并QYDS的特征性5hmC标志物并建立诊断模型：队列1训练集受试者工作特征曲线下面积（Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve, AUC）达0.984，灵敏度0.976，特异度1.000；验证集AUC为0.949，灵敏度0.952，特异度0.952；独立外部验证队列2的AUC为0.934，灵敏度0.886，特异度0.919。此外，结合症状与分子标志物构建的诊断模型在独立外部队列中AUC值达0.864。该研究建立的Epi-DS是一种新型TCM辨证精准诊断方法，所构建的疾病-表型-分子网络揭示了TCM的表观遗传基础，并鉴定出AF合并QYDS的分子诊断标志物，为理解TCM辨证分子基础及中西医融合诊断提供了范例。
研究背景与意义
传统中医（TCM）辨证是处方制定的基础，但目前依赖医师采集的症状、体征等信息主观性较强，易导致诊断不清与治疗偏差，疗效欠佳。尽管TCM现代化进程中已建立基因组学、代谢组学等客观数据库，但基于这些数据的证候诊断模型尚未达到理想精度。表观遗传学通过DNA甲基化与去甲基化等机制在不改变序列的前提下动态调控基因表达，与TCM整体观、阴阳动态平衡理念高度契合，且环境因素对表观基因组的重塑作用也与TCM强调的证候诱因一致，但表观遗传在TCM诊断中的应用仍处于探索阶段。5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC）是DNA去甲基化过程的关键中间体，被称为DNA“第六碱基”，其血浆游离DNA图谱已被证实可作为多种疾病的表观遗传标志物。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）可稳定携带反映机体疾病状态的遗传物质，其中evDNA（细胞外囊泡DNA）在心血管疾病诊断中具有独特价值。气阴两虚证（QYDS）是心房颤动（AF）最常见的TCM证型，临床疗效确切，但缺乏客观分子诊断依据。为此，研究人员以AF合并QYDS为切入点，应用5hmC-Seal测序技术探索其表观遗传特征，构建疾病-表型-分子网络并鉴定诊断标志物，相关成果发表于《Chinese Medicine》。
关键技术与方法
研究为单中心前瞻性设计，纳入两个独立AF队列共196例患者，分为QYDS组与非气阴两虚证（NQYDS）组。采用5hmC-Seal技术检测血浆evDNA全基因组5hmC修饰谱，通过加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）解析模块功能，结合症状数据库Symmap与药物靶点数据库HIT 2.0构建多维关联网络。应用12种特征选择算法筛选差异区域，采用集成学习框架嵌套重复交叉验证构建诊断模型，并在独立外部队列中进行盲法验证，所有统计分析均采用R语言完成。
研究结果
患者基线特征
队列1（n=124）与队列2（n=72）中QYDS与NQYDS组在年龄、体重指数、血压、心功能指标、生化参数等基线特征上均无显著差异，组间匹配良好，排除混杂因素干扰。
全基因组5hmC图谱差异
QYDS组血浆evDNA的5hmC修饰水平显著低于NQYDS组与健康人群。5hmC标记主要富集于远端基因间区、内含子区及启动子区，与心血管疾病相关研究一致。主成分分析（PCA）与热图分析显示，差异羟甲基化区域（Differentially Hydroxymethylated Regions, DhMRs）可有效区分两组患者。关键调控因子TET2（Ten-eleven translocation 2）的5hmC信号在QYDS组显著降低。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示QYDS组在扩张型心肌病、肥厚型心肌病及钙信号通路等心脏相关通路中显著上调。
WGCNA与功能富集分析
共鉴定出1817个上调与1921个下调的差异羟甲基化基因（Differentially Hydroxymethylated Genes, DhMGs），构建10个分子模块。其中红色模块与主动脉瓣形态发育、心肌细胞动作电位正相关，涉及IGF1R、ROCK2、GATA5等基因；棕色模块与免疫细胞分化负相关，核心基因为TGFBR2。模块功能涵盖细胞内定位维持、GTP酶活性、嘌呤代谢、神经元发育等，与QYDS的气血亏虚、免疫调节异常等传统认知相吻合。
症状与药物网络关联
Symmap数据库分析显示，DhMGs与疲劳、低热、烦躁潮热、大便干结等QYDS典型症状密切相关，核心基因为PIK3CA、PIK3R1等。HIT 2.0数据库分析表明，DhMGs与人参、生姜、党参、大枣、五味子等治疗QYDS的常用中药靶点高度重叠，核心基因为EGF、BCL2等，验证了5hmC-Seal鉴定的DhMGs的可靠性。
生物标志物筛选与模型构建
通过LDA、逻辑回归、随机森林三种算法联合筛选，最终确定SNORA59B、RCC1、GLIS1、FILIP1L、TFRC、PDLIM5、ZFAND3、CRYGN、APBA2共9个DhMGs作为诊断标志物。模型在队列1训练集AUC达0.984，验证集AUC为0.949；在独立外部队列2中AUC仍保持0.934，单个标志物AUC均大于0.7，显示出优异的诊断效能。
联合症状的诊断模型
将9个分子标志物与气短、盗汗两个临床症状整合后，构建的简化模型仅含3个DhMGs（SNORA59B、ZFAND3、APBA2）与2个症状，在训练集AUC达1.000，外部队列AUC为0.864，实现了分子标志物精简与诊断精度的平衡。
讨论与结论
研究首次将5hmC-Seal技术应用于TCM证候的表观遗传解析，证实血浆evDNA的5hmC修饰特征可有效区分AF的QYDS与NQYDS亚型，突破了传统证候诊断的主观性局限。构建的疾病-表型-分子网络揭示了QYDS的表观遗传基础，鉴定的9个5hmC标志物功能涵盖免疫调节、能量代谢、细胞周期等，与TCM理论中气阴两虚的病机高度契合。Epi-DS技术为TCM现代化提供了客观分子依据，结合症状与分子标志物的诊断模型为中西医结合诊断开辟了新路径。研究同时指出，未来需整合多维度表观基因组技术、扩大多中心样本量并开展实验验证，以进一步阐明TCM证候与表观遗传的具体调控机制。
