白尾鹿（*Odocoileus virginianus*）*PRNP*测序揭示AF（Q95G96/H95G96）相对于AC（Q95G96/Q95S96）在慢性消耗病中的优势

《Veterinary Research》：Odocoileus virginianus PRNP sequencing reveals AF (Q95G96/H95G96) advantage over AC (Q95G96/Q95S96) against chronic wasting disease

慢性消耗病（CWD）是一种影响鹿科动物的高度传染性海绵状脑病。*PRNP*基因编码朊蛋白（PrP），其变异影响疾病进展与易感性。蛋白序列是PrP毒株及其跨物种传播能力的关键决定因素。白尾鹿*PRNP*测序已揭示影响疾病的非同义多态性——c.285A>C（Q95H）和c.286G>A（G96S）。先前的*PRNP*扩增方案因广泛使用的正向引物导致等位基因脱落，从而误判了纯合子与杂合子鹿。研究人员使用重新设计的引物（命名为Ov-PRNP-F2）对先前被归类为纯合子的586只鹿进行重测序，发现128只杂合子。随后，研究人员使用Ov-PRNP-F2对额外的CWD阳性及阴性鹿进行测序以校正脱落，并利用伊利诺伊州22个县的778只CWD阳性和3,070只CWD阴性鹿估计PrP变异易感性及CWD风险，这是迄今为止最大的*PRNP*序列数据集。编码PrP变异组合C（96S）和F（95H）的动物对CWD的易感性最低（OR=0.03，p<0.001），相较于编码两份PrP变异A（95Q;96G）拷贝的鹿。一项新发现是，编码单份PrP 95H的鹿比编码单份PrP 96S的鹿对CWD的易感性更低（OR=0.40，p<0.001）。研究结果支持利用基因分型方法绘制景观尺度上的CWD易感性图谱，关注PrP变异频率以改进CWD流行病学风险模型。

本研究发表于《Veterinary Research》，旨在通过优化*PRNP*基因扩增方法，精确评估白尾鹿朊蛋白变异与慢性消耗病易感性的关联。研究背景源于CWD作为传染性海绵状脑病（TSE）对鹿科野生动物构成的严重威胁。CWD通过细胞朊蛋白（PrP^C）向错误折叠的感染性朊蛋白（PrP^Sc）转化而致病，传播途径包括直接接触和环境间接接触。由于朊蛋白疾病不引发免疫应答，宿主*PRNP*基因变异成为决定易感性的关键因素。白尾鹿因种群密度高、分布广，是CWD影响最严重的物种之一。此前研究已识别*PRNP*编码区的两个关键非同义单核苷酸多态性（SNP）：c.285A>C（Q95H）和c.286G>A（G96S），其与CWD抗性相关，但先前使用的CWD-223/CWD-224引物对存在等位基因脱落问题，导致基因型误判，且PrP A/C与A/F组合间的相对优势尚不明确。因此，研究人员亟需建立无脱落风险的扩增方案，并在大规模样本中精确评估各变异组合的保护效应。

研究人员开展了以下研究：首先设计并验证新引物Ov-PRNP-F2，对既往被CWD-223引物误判为纯合子的样本进行重测序；随后扩大样本量，对伊利诺伊州22个县的鹿群进行*PRNP*测序和贝叶斯单倍型推断；最后通过Fisher精确检验计算各PrP变异及组合的优势比（OR），评估其与CWD状态的关联。研究得出以下主要结论：Ov-PRNP-F2引物成功解决了等位基因脱落问题，鉴定出128只先前被误判的杂合子；PrP变异F（95H）对CWD的保护效应优于变异C（96S）；编码C/F组合的鹿对CWD的易感性最低。该研究的重要意义在于为CWD流行病学风险模型提供了更精确的遗传参数，并为基于遗传背景的野生动物管理策略奠定了科学基础。

本研究采用的关键技术方法包括：样本来源于伊利诺伊州自然资源部CWD监测管理项目，涵盖22个县经猎人收获、针对性扑杀及特殊许可采集的肌肉组织，包括414只CWD阳性和926只CWD阴性鹿的原始样本，并整合既往研究的2,150只杂合子序列及586只可获取存档组织的既往"纯合子"样本；引物设计与验证方面，采用Ov-PRNP-F2正向引物替代CWD-223，通过Primer3设计并结合CWD-224反向引物，经36只已知杂合子验证一致性；分子实验流程包括DNeasy试剂盒提取基因组DNA、PCR扩增、外切酶I及虾碱性磷酸酶纯化、双向Sanger测序；生物信息学分析采用Sequencher拼接、MUSCLE比对、PHASE算法进行贝叶斯单倍型推断，并通过自定义R脚本进行变异匹配；统计分析使用Fisher精确检验计算优势比，采用Benjamini-Hochberg程序校正多重检验假发现率。

研究结果部分按以下小标题展开：

**等位基因脱落由正向引物Ov-PRNP-F2解决**：通过引物验证和586只伊利诺伊鹿的重测序，研究人员更新了128只动物的基因型信息为杂合子。c.286G>A（96S）多态性相关的等位基因脱落最为普遍，占总体脱落的主导地位。在2,736只经两种引物测序的鹿中，4.6%（128/2,736）因等位基因脱落被重新鉴定为杂合子，脱落发生频率与CWD状态无显著关联（p=0.2）。单倍型C的脱落发生率最高（2%，56/2,736），而单倍型I的每单倍型脱落频率最高（27%，9/33）。

**22个伊利诺伊县鹿群PRNP序列的贝叶斯单倍型推断**：研究人员对4,076只鹿进行基因分型（较先前研究2,899只大幅增加），基于贝叶斯相位推断鉴定出10个频率大于0.5%的单倍型（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J），产生8,152条相位单倍型序列。单倍型多样性（H_d）为0.81，核苷酸多样性（π）为0.002。三个主要PrP变异频率为：A（74.9%）、C（19.0%）、F（4.7%）。中位连接网络无推断节点。

**PRNP单倍型及PrP变异频率按CWD状态分布**：单倍型在CWD阳性与阴性鹿间分布不均。编码变异C的单倍型C和I在CWD阴性鹿中更常见（C：20.3% vs 8.8%；I：0.8% vs 0.3%）；编码变异F的单倍型F同样偏多于CWD阴性鹿（5.6% vs 1.2%）。

**CWD阳性病例与PrP变异的统计学关联**：PrP变异C和F与CWD的关联显著低于变异A（C：OR=0.35，p<0.001；F：OR=0.16，p<0.001），且变异F的CWD关联显著低于变异C（OR=0.47，p=0.002）。反向比较显示变异A相对变异F的OR为6.14（p<0.001）。

**CWD阳性病例与PrP变异组合的关联**：仅表达PrP变异C和F的鹿（C/C、C/F、F/F）对CWD的易感性显著低于表达变异A的鹿（OR=0.20，p<0.001）。相对于A/A参考组，C/F组合保护效应最强（OR=0.03），依次为A/F（OR=0.14）、C/C（OR=0.18）、A/C（OR=0.34），均具有统计学显著性（p<0.001），仅F/F因样本量不足未达显著（OR=0.63，p=0.734）。A/F与A/C的95%置信区间无重叠，证实A/F的保护优势。

讨论部分，研究人员首先承认野生种群研究的固有限制：未纳入活体动物、病例对照设计导致空间随机性丧失、未评估年龄结构及个体亲缘关系、20年监测期间未评估毒株动态变化等。随后重点阐述了以下方面：Ov-PRNP-F2引物避免了等位基因脱落，提高了种群等位基因频率估计的准确性，尤其关键的是先前脱落的单倍型多编码保护性变异C，证实了c.286G>A变异与脱落突变的共遗传现象；本研究首次从统计学上证实A/F组合较A/C组合具有显著优势（OR=0.40，p<0.001），C/F组合保护效应最强，但F/F与C/F的比较因样本量限制无法得出结论；关于杂合优势问题，研究人员指出虽不能阐明具体机制，但结果提示变异F可能具有比变异C更低的错误折叠倾向，这与谷氨酰胺残基增加朊蛋白转化倾向的发现一致，建议未来利用AlphaFold等蛋白互作模拟工具深入探究；研究进一步强调*PRNP*多态性对CWD防控的管理应用价值，提出可针对去除A/A个体、保留含C或F变异个体的策略方向，同时警示该策略可能导致新毒株产生及亚临床携带者传播等潜在风险；最后指出当前部分实验室基因分型方法未纳入Q95H位点，建议未来研究将c.285A>C多态性纳入CWD风险评估，以完善景观尺度的易感性制图和流行病学模型。

研究结论部分翻译如下：研究人员已证明，在白尾鹿中解决等位基因脱落对于准确估计*PRNP*等位基因频率至关重要，尤其是对于携带有利多态性c.286G>A（G96S）的等位基因。通过对来自CWD检测野生白尾鹿的最大*PRNP*序列数据集进行优势比分析，研究人员发现表达PrP变异C（96S）和F（95H）的动物具有显著更强的抗CWD优势，即使与高错误折叠倾向变异PrP A（95Q, 96G）共表达时亦然。这突出表明，在管理白尾鹿群的CWD时，需要考虑PrP变异，特别是Q95H位点。