全基因组CRISPR筛选鉴定调控黑色素瘤靶向治疗与T细胞免疫多效性耐药的microRNA

《Advanced Science》：Genome-Wide CRISPR Screen Identifies a microRNA Orchestrating Pleiotropic Resistance to Targeted Therapy and T Cell Immunity in Melanoma

癌症中靶向治疗与免疫治疗的获得性耐药是重大临床挑战，但其交叉耐药的分子机制尚不明确。研究人员假设特定microRNA（miRNA）的缺失可同时增强黑色素瘤对靶向药物及CD8+T细胞介导的细胞毒作用的抵抗。通过整合全基因组miRNA CRISPR敲除筛选、细胞模型、纵向临床样本及体内实验，研究人员鉴定出miR-18a是多效性耐药的关键上游调控因子。研究显示，miR-18a缺陷通过双重机制驱动耐药：在MAPK抑制期间解除对AJUBA调控的Hippo信号通路的抑制，以及增强THBS1–CD47相互作用从而损害肿瘤细胞与CD8+T细胞间的免疫突触形成。此外，hnRNP A1通过调控miR-18a表达介导交叉耐药。这些发现提示靶向非编码RNA脆弱位点可能是克服黑色素瘤复杂耐药机制、改善临床结局的有前景的治疗策略。

本研究发表于《Advanced Science》，针对黑色素瘤治疗中靶向治疗与免疫治疗交叉耐药的临床难题展开。当前患者经初始治疗后复发常伴随后续治疗响应下降，且瘤内异质性与克隆进化加剧耐药复杂性，但交叉耐药的上游分子机制仍不明确。研究人员通过构建覆盖2185个miRNA的全基因组CRISPR敲除文库，结合细胞模型、120例配对临床样本（含61例靶向治疗、59例免疫治疗队列）及体内实验，系统解析miR-18a在黑色素瘤多效性耐药中的调控作用。研究发现miR-18a缺失通过AJUBA-Hippo轴介导靶向治疗耐药，通过THBS1-CD47轴损害CD8⁺T细胞杀伤功能，且hnRNP A1是miR-18a的上游调控因子。该研究首次从非编码RNA层面揭示黑色素瘤交叉耐药的核心机制，为克服临床耐药提供了新靶点。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：构建靶向miRNA前体的全基因组CRISPR敲除筛选文库，开展BRAF V600E突变黑色素瘤细胞系的靶向治疗与CD8⁺T细胞共培养双筛选；整合120例黑色素瘤患者配对临床样本的转录组与生存数据，计算miR-18a活性评分；利用CRISPR基因编辑构建miR-18a及hnRNP A1敲除细胞系，结合裸鼠移植瘤模型与C57BL/6小鼠同系移植瘤模型验证体内表型；通过单细胞转录组测序解析肿瘤微环境免疫细胞组成变化，采用双荧光素酶报告实验验证miR-18a与靶基因的调控关系。

研究结果如下：

2.1 全基因组CRISPR敲除筛选发现miR-18a是黑色素瘤对维莫非尼（VEM）与CD8⁺T细胞双重耐药的关键介质。研究人员构建覆盖2185个miRNA的sgRNA文库，在A375细胞中分别开展VEM处理与CD8⁺T细胞共培养筛选，富集分析显示miR-18a在两个筛选中均显著富集。功能验证证实miR-18a敲除赋予细胞对VEM、MEK抑制剂（MEKi）、ERK1/2抑制剂的耐药，并降低CD8⁺T细胞杀伤敏感性，回补miR-18a模拟物可逆转耐药表型。

2.2 miR-18a失调与黑色素瘤靶向及免疫治疗不良预后相关。诱导获得的VEM耐药（A375-VR）与CD8⁺T细胞耐药（A375-TR）细胞系均显示miR-18a显著下调。对120例配对临床样本分析显示，治疗反应差的患者miR-18a评分下降更显著，高基线miR-18a评分患者中评分升高者生存更优；免疫治疗后miR-18a评分下降伴随CD8⁺T细胞比例降低。

2.3 miR-18a缺失与细胞模型及临床样本中的肿瘤内在耐药通路改变相关。转录组富集分析显示miR-18a敲除后，VEM处理组富集Hippo、PI3K-AKT等通路，CD8⁺T细胞共培养组富集TGF-β、PI3K-AKT等通路；单细胞转录组与临床样本分析进一步证实，高miR-18a评分患者靶向治疗组Hippo通路富集，免疫治疗组TGF-β通路富集。

2.4 miR-18a缺陷通过AJUBA介导的Hippo信号通路赋予VEM耐药。miR-18a-5p直接靶向抑制AJUBA表达，其缺失导致AJUBA上调，进而抑制LATS1/2激酶活性，促进YAP核转位与下游促存活基因表达。YAP抑制剂verteporfin单药或联合VEM可逆转miR-18a敲除细胞的耐药，体内移植瘤实验中miR-18a模拟物联合VEM显著抑制肿瘤生长。

2.5 miR-18a缺陷通过THBS1–CD47依赖机制损害CD8⁺T细胞毒性。miR-18a-5p直接靶向THBS1，其缺失导致THBS1上调，通过THBS1–CD47相互作用抑制CD8⁺T细胞活化与脱颗粒功能。体内同系移植瘤模型中，miR-18a模拟物治疗降低肿瘤Thbs1与Cd47表达，减少CD8⁺T细胞界面处两者共定位；阻断CD47可恢复miR-18a敲除细胞对T细胞杀伤的敏感性。

2.6 hnRNP A1是miR-18a介导多效性耐药的上游调控因子。RNA免疫沉淀证实hnRNP A1结合miR-18a前体，VEM处理与CD8⁺T细胞共培养均下调hnRNP A1表达，进而降低miR-18a水平；过表达hnRNP A1可上调miR-18a并逆转耐药表型，临床样本检测显示hnRNP A1高表达与miR-18a高水平正相关。

讨论部分指出，本研究通过无偏倚CRISPR筛选首次系统揭示miRNA在黑色素瘤交叉耐药中的因果作用，阐明miR-18a通过Hippo与TGF-β通路分别调控靶向治疗耐药与免疫逃逸的双重机制。研究局限性在于CRISPR敲除对成熟miRNA表达的调控精度有限，未来可采用CRISPR-Cas13d系统实现更精准的miRNA扰动。结论强调miR-18a是连接靶向治疗耐药与免疫逃逸的核心节点，靶向该非编码RNA脆弱位点有望成为克服黑色素瘤复杂耐药的新策略，相关成果为临床转化提供了机制基础。