《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Deciphering differential mRNA and lncRNA expression profiles in response to PEG simulated drought stress in cucumber (Cucumis sativus L.)
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黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科中一种重要的果菜类蔬菜，起源于印度约3000年前，在烹饪、治疗和化妆品领域有广泛应用。干旱胁迫，尤其是在干旱和半干旱地区，对黄瓜种植造成严重影响。本研究使用两种表型对比鲜明的黄瓜品系：WBC-23-2（耐旱）
黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科中一种重要的果菜类蔬菜，起源于印度约3000年前，在烹饪、治疗和化妆品领域有广泛应用。干旱胁迫，尤其是在干旱和半干旱地区，对黄瓜种植造成严重影响。本研究使用两种表型对比鲜明的黄瓜品系：WBC-23-2（耐旱）和DGPC-59（干旱敏感）来探究其对干旱胁迫的分子响应。通过聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫，并评估了其对生理和生化性状的影响。耐旱品系表现出更轻的叶片萎蔫和更高的相对含水量（RWC）。基于这些生理指标，研究人员采用转录组学分析来鉴定其潜在的调控网络。分析鉴定了4,736个差异表达基因（DEGs），表明耐旱品系的卓越韧性主要由光合作用和谷胱甘肽代谢相关基因的优先激活所驱动。相反，干旱敏感基因型则在有机氮化合物分解代谢和缺水响应通路上富集。这种差异进一步体现在155个不同家族的转录因子（TFs）的调控上，表明两个品系具有不同的调控结构。此外，研究还鉴定了774个干旱响应的长链非编码RNA（lncRNAs），它们通过顺式（cis）、反式（trans）和竞争性内源RNA（ceRNA）机制调控基因表达。与耐旱性相关的关键候选基因包括WAT1相关蛋白At5g64700、类甜蛋白、小檗碱桥酶类18、推定的WRKY转录因子和病程相关蛋白1。本研究揭示了干旱响应背后由mRNA、lncRNA和转录因子构成的复杂调控网络，并为培育耐旱黄瓜品种奠定了有价值的基础。研究人员开发并公开了一个基于网络的基因组资源CsDTDb，以促进未来与黄瓜抗旱相关的功能基因组学研究。
本研究旨在通过比较两个表型对比鲜明的黄瓜品系——耐旱品系WBC-23-2和干旱敏感品系DGPC-59——对聚乙二醇模拟干旱胁迫的响应，揭示黄瓜应对干旱的分子调控网络。研究首先对两个品系的幼苗进行干旱处理，并评估了其一系列生理指标，包括叶片萎蔫情况、相对含水量、冠层温度差、净光合速率以及总可溶性蛋白含量。结果显示，耐旱品系WBC-23-2表现出更强的维持水分平衡和光合效率的能力，而干旱敏感品系DGPC-59则表现出严重的生理胁迫症状。
基于这些表型差异，研究人员对两个品系在胁迫和对照条件下的叶片进行了RNA-seq转录组测序。通过对高质量测序数据的生物信息学分析，共鉴定了4,736个差异表达蛋白编码基因（DEGs）和774个新的干旱响应长链非编码RNA（lncRNAs）。分析表明，耐旱品系在干旱胁迫下特异性地上调了大量与防御反应、光合作用以及谷胱甘肽代谢相关的基因，这为其在胁迫下维持细胞功能提供了支持。相比之下，干旱敏感品系则主要富集在有机氮化合物分解代谢和水分亏缺响应等通路，暗示其可能处于一种代谢分解状态。
研究还对差异表达基因进行了基因本体论（GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA）。在耐旱品系中，上调基因显著富集在“防御反应”、“谷胱甘肽代谢过程”和“光系统I光捕获”等生物过程；而下调基因则较少。敏感品系的上调基因则显著富集在“有机氮化合物分解代谢”、“蛋白质酶体蛋白分解代谢”和“缺水响应”等通路。基因集富集分析显示，耐旱品系中与胁迫响应正相关，而基础细胞过程被下调；敏感品系中仅发现基础过程下调。
研究人员进一步鉴定了155个受干旱胁迫调控的转录因子（TFs），涵盖ERF、bHLH、WRKY、MYB等多个家族。其中，如WRKY51、bHLH78和ERF109等转录因子仅在耐旱品系中被特异性调控，而另一些如TINY和HSF-C1则仅在敏感品系中被上调。这些差异调控的转录因子构成了干旱响应特异性调控网络的核心。
研究重点分析了关键功能基因的调控。在光合作用方面，耐旱品系特异性上调了数个光合相关基因，而敏感品系则普遍下调了细胞色素相关基因，这可能解释了两者在光合效率上的差异。在苯丙烷代谢途径中，七个苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因仅在耐旱品系中被上调，表明其通过增强该途径合成保护性次级代谢物来应对胁迫。热休克蛋白（HSP）和细胞色素相关基因也主要在耐旱品系中被上调。
研究人员通过分析lncRNA对其邻近蛋白编码基因（顺式调控）的影响，发现1887个基因可能受到lncRNA的顺式调控。在干旱敏感品系中，lncRNA与其靶基因的表达普遍呈负相关，表现为一种拮抗调控模式；而在耐旱品系中，这种相关性消失，转而呈现协同调控模式，即lncRNA与其靶基因（如DIR22, DnaJ2）常被共同上调。这表明耐旱品系可能利用lncRNA作为转录共激活因子来协调激活防御基因。
通过psRNATarget平台分析，研究人员鉴定了844个涉及255个不同miRNA和188个不同lncRNA的相互作用，表明lncRNA可能作为内源靶标模拟物（eTM）通过竞争性结合miRNA来调控基因表达。其靶基因的GO富集分析显示，主要与初级代谢和细胞组织相关。
最后，研究人员通过随机选择的18个差异表达基因进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，其表达模式与RNA-seq数据高度相关（相关系数0.98），证实了转录组数据的可靠性。此外，研究还开发了一个名为CsDTDb的在线数据库，整合并公开了本研究中关于两个黄瓜品系干旱胁迫的转录组数据和lncRNA信息，为未来的研究提供了便利的资源平台。
讨论部分综合了上述结果。研究表明，耐旱品系WBC-23-2通过维持较高的相对含水量、较低的冠层温度差和较高的净光合速率，展现了其生理层面的抗旱优势。在分子层面，这种优势与大量特异性上调的基因表达程序相关，特别是那些参与光合作用、谷胱甘肽代谢（用于活性氧清除）和防御反应的基因。相比之下，干旱敏感品系DGPC-59在胁迫下表现出显著的蛋白质分解代谢和有机氮化合物分解代谢活跃，这可能是其代谢系统崩溃和衰老的标志。转录因子家族如WRKY、bHLH和ERF的差异调控，为两个品系构建了不同的抗旱信号传导网络。最关键的是，研究揭示了lncRNA在两种基因型中的功能切换：在敏感品系中，lncRNA主要作为顺式作用抑制因子，导致靶基因（如水通道蛋白基因PIP2-1）被压制，这是一种可能限制水分流失但无法建立积极防御的“恐慌”反应；而在耐旱品系中，lncRNA则倾向于作为转录共激活因子，与防御相关基因（如DIR22, DnaJ2）协同上调，积极强化细胞壁和蛋白质保护，从而赋予其抗旱韧性。
本研究结论指出：本研究通过转录组学分析，深入解析了黄瓜对干旱胁迫的响应机制。研究鉴定了4,736个差异表达蛋白编码基因和774个差异表达长链非编码RNA。耐旱品系表现出更少的叶片萎蔫和更低的冠层温度差，并在胁迫下优先激活与防御反应、光合作用和谷胱甘肽代谢相关的基因。相反，敏感品系则在有机氮化合物分解代谢和缺水响应通路中富集。此外，155个转录因子在不同基因型间存在差异调控，表明存在与干旱耐受性相关的独特调控网络。重要的候选基因包括WAT1相关蛋白、类甜蛋白、WRKY转录因子和病程相关蛋白1等。这些发现为深入理解黄瓜抗旱性的分子机制提供了新的见解，并提供了宝贵的基因组资源，可为通过基因工程或CRISPR编辑等技术培育抗旱黄瓜新品种提供理论基础和功能靶点。CsDTDb数据库的建立也为未来的黄瓜抗旱育种研究提供了支持。
