基于CRISPR/RspCas13d的GII型诺如病毒现场快速检测系统的开发

《Journal of Virological Methods》：Development of a CRISPR/RspCas13d-based on-site rapid detection system for GII Norovirus

林莉|赵娜|丁凯|左雷|甘玉露|刘宇|孔凌汉|张学健|赵宇

中国重庆市万州区疾病预防控制中心

摘要

诺如病毒（NoVs）是急性病毒性胃肠炎的主要原因，也是严重的公共卫生问题。现有的检测方法在检测速度、设备要求或灵敏度方面存在局限性。在这项研究中，我们结合了RT-RAA、T7转录和RspCas13d系统，开发了一种快速、灵敏且特异的GII NoV检测方法。首先表达了RspCas13d蛋白并将其纯化，然后设计了针对GII NoV保守区域的RT-RAA引物和crRNA。该方法经过优化后，对其特异性、灵敏度和临床性能进行了评估。结果表明，RT-RAA-RspCas13d方法具有高特异性，且不会与其他常见肠道病毒发生交叉反应。检测限为5拷贝/μL。在临床粪便样本中，该方法的检测结果与RT-qPCR高度一致。这种方法快速、简单、灵敏且特异，为GII NoV的快速现场检测提供了可靠的工具。

引言

诺如病毒（NoVs）属于杯状病毒科（Caliciviridae）中的诺如病毒属（Norovirus）。它们是无包膜、球形、单链正链RNA病毒。作为人类急性腹泻最常见的非细菌性病因之一，诺如病毒已成为发达国家和发展中国家公共卫生的主要威胁（Cates等人，2020年；Chaimongkol等人，2023年）。诺如病毒于1972年由Albert Kapikian及其团队首次发现。该病毒直径约为27-35纳米，基因组长度为7.3-8.5千碱基对（kb），包含三个开放阅读框（ORFs）。ORF1编码参与病毒复制的非结构蛋白，ORF2和ORF3分别编码主要衣壳蛋白（VP1）和次要衣壳蛋白（VP2）。根据衣壳蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的基因序列，诺如病毒被分为10个基因组群（Barclay等人，2025年；Chhabra等人，2019年）。诺如病毒主要通过粪-口途径传播，也可通过呕吐产生的气溶胶传播，这大大增加了传播风险，可能导致严重的公共卫生事件。感染诺如病毒的人通常会出现呕吐、腹泻、发热和腹痛等症状（Hayashi等人，2024年；Muzes和Sipos，2025年）。根据世界卫生组织（WHO）的数据，诺如病毒每年在全球导致6.85亿例腹泻病例，每年造成超过20万人死亡。全球直接医疗费用为42亿美元，总社会成本达到603亿美元（Bartsch等人，2020年；Kendra等人，2022年）。GII NoV是引发胃肠炎暴发的主要病原体。在中国，大多数诺如病毒感染由GII型引起，它导致了大多数暴发（Ai等人，2025年；Jing等人，2025年）。

目前，免疫学检测方法（Pombubpa和Kittigul，2012年；Takanashi等人，2008年）、RT-PCR和实时定量RT-PCR（RT-qPCR）是主要的诺如病毒检测方法（Chhabra等人，2021年；Liu等人，2020年；Yi等人，2024年）。然而，这些方法存在明显局限性。免疫学检测灵敏度较低，可能会漏检早期或轻度感染。qPCR具有高灵敏度和特异性，但需要昂贵的设备、受过培训的人员以及较长的检测时间。这些因素限制了病原体的快速现场检测，尤其是在偏远或资源有限的地区。即时检测（POCT）可以缩短检测时间并实现快速诊断，同时克服了传统医疗设备的空间限制，适用于多种场景。因此，POCT对于预防和控制传染病暴发至关重要。目前尚无针对GII NoV的特异性药物或批准疫苗。因此，开发快速、及时和准确的检测方法对于应对GII NoV暴发至关重要。

CRISPR-Cas系统是原核生物在长期进化过程中发展出的一种适应性免疫系统，可保护原核生物免受噬菌体和质粒等外来遗传元素的侵害（Koonin和Wolf，2015年；van der Oost等人，2009年）。迄今为止，CRISPR-Cas系统已被广泛用于开发针对多种病原体的POCT方法（Chen等人，2022年；Li等人，2019年；Zhu等人，2023年）。常用的等温扩增技术包括重组酶辅助扩增（RAA）和环介导的等温扩增（LAMP）。当与Cas12a和Cas13a系统结合使用时，这些方法可以提高分子诊断的准确性并减少假阳性结果。2018年，David A. Scott及其团队发现了一种新的Cas13系统，能够特异性地切割RNA，命名为RspCas13d（Yan等人，2018年）。RspCas13d来源于反刍球菌属（Ruminococcus sp.）在crRNA的引导下，RspCas13d可以特异性切割与crRNA互补的靶标RNA。重要的是，RspCas13d不需要靶标识别所需的原间隔序列（PFS），这一特点使其在靶标选择方面优于Cas12a和Cas13a（Qiao等人，2021年；Yan等人，2018年）。尽管RspCas13d已被用于PDCoV等病原体的检测，但迄今为止尚未有其在诺如病毒检测中的应用报道（Xu等人，2026年；Zhao等人，2023年）。

在这项研究中，我们选择了高效 的RspCas13d系统作为核酸检测工具。我们结合了逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）、T7体外转录以及RspCas13d的RNA切割活性，建立了一种名为RT-RAA-RspCas13d的新POCT方法，该方法对GII NoV具有高灵敏度、高特异性、快速检测和简单操作的特点。这项工作为GII NoV的快速检测提供了新的技术途径，并扩展了CRISPR系统在病原体核酸检测中的应用。

章节片段

病毒和核酸提取

本研究中使用的病原微生物核酸存储在重庆市万州区疾病预防控制中心，包括人腺病毒（HAdV）、轮状病毒（RoV）、沙波病毒（SaV）、大肠杆菌（E. coli）、沙门氏菌（Salmonella）、GI NoV和GII NoV。重庆市万州区疾病预防控制中心提供了35份人类粪便样本。核酸使用自动核酸提取仪进行提取。

RT-RAA-RspCas13d检测原理

建立的RT-RAA-RspCas13d检测GII NoV的原理如下（图1）：对GI NoV和GII NoV的完整基因组序列进行了多序列比对，设计了针对GII NoV保守靶区的RT-RAA扩增引物和crRNA，同时使用基因型特异性的crRNA来实现对这两个基因组群的特异性识别和区分。

以GII NoV RNA为模板，生成了大量目标DNA片段

讨论

诺如病毒是全球引发急性胃肠炎暴发的重要病原体之一（Carlson等人，2024年）。它们的传播途径多样，在普通人群中易感性强。学校、幼儿园和养老院等封闭环境中经常发生暴发，这对公共卫生应急响应和早期预警提出了高要求。在缺乏广谱疫苗和特异性抗病毒药物的情况下，开发

伦理批准

本文不包含作者进行的任何涉及人类参与者或动物的研究。该研究未招募人类受试者，未实施任何临床干预程序，也未涉及可识别的个人隐私信息。实验中使用的RNA样本仅用于检测方法的性能验证。

(Li等人，2018年；van der Oost等人，2009年)

资助

本研究得到了重庆市万州区科教卫联合医学研究计划（wzwjw-kw2024007）、重庆市疾病预防控制局研究项目（2026JKXM001）和重庆市公共卫生重点专项项目的支持。

CRediT作者贡献声明

林莉：撰写——初稿，方法学部分。赵娜：撰写——初稿，方法学部分。甘玉露：方法学部分。刘宇：数据管理。丁凯：软件处理，数据分析。左雷：数据管理。孔凌汉：数据管理。张学健：撰写——初稿，数据管理，概念构思。赵宇：撰写——初稿，项目管理，方法学，资金获取。

作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。