《Environmental Microbiology Reports》：Full-Length 16S and 18S rRNA Long-Read Sequencing Reveals Gut Microbiome Diversity in the European Brown Hare (Lepus europaeus)
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**摘要翻译：**
欧洲野兔（Lepus europaeus）是一种具有生态学和流行病学重要性但种群数量下降的野生动物，其肠道微生物组特征尚不明确。本研究利用牛津纳米孔长读长测序技术（Oxford Nanopore long-read sequencing）对
**摘要翻译：**
欧洲野兔（Lepus europaeus）是一种具有生态学和流行病学重要性但种群数量下降的野生动物，其肠道微生物组特征尚不明确。本研究利用牛津纳米孔长读长测序技术（Oxford Nanopore long-read sequencing）对30只健康野兔的大肠内容物池化样本进行分析，这些样本分为三组。研究人员在95%和80%序列同一性阈值下进行了比较分类学鉴定，发现多样性估计存在显著差异，较低的阈值揭示了多达十倍的分类群。在所有样本中，共鉴定出40个门、360个科、1027个属和3373个种，包括30个先前未在兔形目（lagomorphs）中报道的分类群。其中包括Monoglobus pectinilyticus、Ruminococcus champanellensis、Odoribacter splanchnicus、Butyricimonas virosa和Akkermansia muciniphila，这些菌群分别与果胶降解、纤维素水解、丁酸产生、粘蛋白降解、胆汁酸转化和氮循环相关。研究还检测到多种与动物和人类健康相关的分类群，支持野兔在“同一健康”（One Health）框架下作为环境微生物组哨兵动物的作用。这些结果表明，分析参数的选择显著影响微生物组的解读，并提供了迄今为止最全面的欧洲野兔肠道微生物组谱。该研究扩展了兔形目的微生物生态学认知，并凸显了长读长测序作为一种有价值的工具，在全球范围内可用于表征不明确宿主物种的野生动物微生物组监测。
**论文解读文章：**
**研究背景与问题**
欧洲野兔（Lepus europaeus）是森林和农业生态系统中的关键物种，其种群在过去几十年内显著下降。这种下降由多种因素导致，包括栖息地丧失、捕食增加以及传染性疾病传播。肠道微生物组是一个动态的微生态系统，在宿主的代谢、营养消化和生态互作中发挥基础性作用。然而，针对野兔肠道微生物组的研究尚不充分，现有科学文献在该领域仍显不足。传统上，基于下一代测序（Next-generation sequencing, NGS）的短读长技术被广泛应用于微生物组研究，但其读长限制（通常100-300 bp）导致在16S rRNA基因测序中通常只能覆盖3-4个可变区，这严重限制了物种水平的精确分辨能力，难以区分近缘微生物分类单元。这一局限性阻碍了对野生动物，特别是像野兔这样研究较少的物种，其肠道微生物组精细结构的深入理解。
**研究目的与方法**
为解决上述问题，研究人员旨在获取野兔肠道微生物组的种群水平谱图，因此采用了样本池化（pooling）策略以强调群落整体的微生物特征。他们利用第三代测序技术（Third-generation sequencing, TGS）中的牛津纳米孔（Oxford Nanopore）平台，对野兔大肠内容物中近全长的16S和18S rRNA基因扩增子进行测序，以克服短读长技术的局限，实现更精确的物种水平分类。研究使用SPARK-TECH公司开发的专有引物，这些引物设计用于靶向超过12万种原核和真核生物，以减少扩增偏差。样本来源于波兰西部卢布林高地的20个狩猎区，在2024年狩猎季期间，共采集30只健康野兔的大肠内容物，并随机分为三组（Z1、Z2、Z3），每组10只个体的样本合并为一个池化样本，以确保足够的DNA产量并减少随机变异。随后，使用牛津纳米孔MinION设备及Q14化学试剂盒进行长读长测序。
**主要研究结果与发现**
研究分析了在95%和80%两种序列同一性阈值下的分类学多样性，得出了一系列重要发现。
* **不同序列同一性阈值下的分类学多样性比较分析**
研究人员计算了两种阈值下的关键生物多样性指标，包括香农多样性指数（Shannon diversity）、物种丰富度（Species Richness）和Chao1估计量等。分析显示，采用80%的阈值，鉴定出的物种数量比95%的阈值高出约一个数量级。例如，在物种水平，Z1样本在80%阈值下检测到约1715个物种，而在95%阈值下仅为168个。维恩图（Venn diagram）可视化进一步证实，在80%阈值下，样本间共享的以及特有的分类单元数量均显著高于95%阈值。Kruskal-Wallis检验表明，无论采用哪个阈值，样本间的显著差异均一致地出现在属（Genus）和种（Species）这两个较低的分类阶元上，说明了在该分类水平上存在可重复的、与阈值无关的分化模式。
* **跨分类层级的分类学组成分析**
这部分深入探讨了阈值选择如何从根本上改变对微生物群落组成的认知。例如，在门（Phylum）水平，拟杆菌门（Bacteroidota）在95%阈值下占主导（59.6%），但在80%阈值下丰度显著降低（25.9%）；反之，螺旋体门（Spirochaetota）在80%阈值下丰度较高（25.2%），但在95%阈值下完全无法检测到。这种显著的差异在纲、目、科、属、种各个层级均有体现。研究还比较了不同阈值下检测到的分类单元丰富度，80%阈值在所有分类水平上检测到的平均分类单元数都更高，在物种水平差异尤为悬殊（约2000种 vs. 200种）。此外，通过与已发表的两项野兔微生物组研究（Stalder et al., 2019; Padula et al., 2021）进行对比，发现本研究鉴定出的多样性远超前者，识别出了大量前所未有的分类群，包括40个门、360个科、1027个属和3373个种。
**结果讨论与结论**
本研究的核心结论在于，序列同一性阈值的选择并非单纯的技术决策，而是影响生物学解读的根本性研究设计考量。在人类微生物组研究中常用的严格阈值（≥95%），对于像野兔这样肠道微生物组在参考数据库中代表性不足的野生动物物种而言，可能并非最佳选择。80%阈值下能鉴定出更多序列，这些序列很可能来源于与数据库中已知参考序列存在差异的生物体，代表了潜在的新的菌株、物种变体或完全未知的分类单元。因此，低于95%阈值的分类结果应被视为“最近的已知近缘参考”，而非确定的物种鉴定。这凸显了在参考数据库覆盖有限的野生动物微生物组研究中使用宽松阈值的潜在价值，即作为事后发现新微生物多样性的工具。
研究同时指出，将研究目标（探索性还是假设驱动）、宿主微生物组的预期多样性以及参考数据库的覆盖情况结合起来，以预先确定阈值策略至关重要。通过在本研究中同时应用80%和95%阈值，研究人员建立了一个有用的框架，能够区分保守的核心微生物组与更广泛的、推测性的新微生物景观。尽管池化样本策略限制了对个体间差异的结论，但它强调了欧洲野兔的种群水平微生物特征，减少了因瞬时或宿主特异性微生物引入的噪音，对于评估物种的生态和流行病学角色（如作为病原体储存宿主或环境微生物多样性指标）具有重要价值。
最后，研究检测到几种先前未在兔形目中报道的重要功能菌群，例如参与果胶降解的Monoglobus pectinilyticus、产生短链脂肪酸（SCFAs）的Ruminococcus champanellensis和Odoribacter splanchnicus，以及具有潜在益生作用的Akkermansia muciniphila。这些发现丰富了野兔肠道微生物组的功能谱。此外，检测到的少量机会性致病菌（如Staphylococcus pseudintermedius和Streptococcus canis）提示了野生动物、伴侣动物和家畜之间微生物交换的可能性，支持了野兔在One Health框架下作为环境微生物组哨兵动物的观点。总之，本研究代表了迄今为止对欧洲野兔微生物组最全面的表征，证明了基于全长16S和18S rRNA基因测序的第三代测序技术结合优化的分析方法，在揭示野生动物微生物组多样性和功能方面的巨大潜力。
