综述：顶复门寄生虫转基因筛选及其作用机制

《The FEBS Journal》：Transgenic selection and underlying mechanisms in apicomplexan parasites

　　

顶复门转基因研究领域因能够将代谢、药物作用与基因工程相耦合的选择标记而发生变革。本综述整合了跨越模式寄生虫（包括弓形虫属（Toxoplasma）、疟原虫属（Plasmodium）、隐孢子虫属（Cryptosporidium）、新孢子虫属（Neospora）、艾美耳球虫属（Eimeria）、巴贝虫属（Babesia）和泰勒虫属（Theileria））三十年的研究进展，阐明了选择标记如何推动基因组工程的发展。研究人员解析了正选择（positive selection）与负选择（negative selection）药物筛选的原理及分子机制，并着重阐述了标记回收（marker recycling）策略。文中将实操指导与失败诊断相结合，明确了决定转基因筛选在体外（in vitro）或体内（in vivo）成功的关键因素。展望未来，研究人员提出了扩展工具箱的新方向：利用营养缺陷型（auxotrophy）、引入正交抗性基因（orthogonal resistance genes）以及开发基于CRISPR的无标记编辑技术。研究人员同时讨论了转化应用的限制因素，特别是疫苗研发中对自切除（self-excising）或瞬时标记的需求、针对非模式物种筛选体系的适配，以及利用选择标记组合（selection marker cocktails）进行通路尺度工程的价值。通过整合模型、机制、方法与模式，本文为寄生虫工程学提供了严谨的框架，并为开发新型正交、宿主友好型选择策略指明了清晰路径。

缩略语

本研究涉及的常用缩略语包括：BSD（Blasticidin S deaminase，杀稻瘟素S脱氨酶）、CAT（Chloramphenicol acetyltransferase，氯霉素乙酰转移酶）、DHFR-TS（Dihydrofolate reductase–thymidylate synthase，二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶）、DiCre（Dimerizable Cre recombinase，二聚化Cre重组酶）、G418（Geneticin，遗传霉素）、GCV（Ganciclovir，更昔洛韦）、hDHFR（Human dihydrofolate reductase，人源二氢叶酸还原酶）、HXGPRT（Hypoxanthine–xanthine–guanine phosphoribosyltransferase，次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）、IMPDH（Inosine monophosphate dehydrogenase，肌苷单磷酸脱氢酶）、MPA（Mycophenolic acid，霉酚酸）、NEO（Neomycin phosphotransferase，新霉素磷酸转移酶）、PAC（Puromycin N-acetyltransferase，嘌呤霉素N-乙酰转移酶）、UPRT（Uracil phosphoribosyltransferase，尿嘧啶磷酸核糖转移酶）、WR99210（抗叶酸药物WR99210）、yDHODH（Yeast dihydroorotate dehydrogenase，酵母二氢乳清酸脱氢酶）、yFCU（Yeast cytosine deaminase–UPRT fusion，酵母胞嘧啶脱氨酶-UPRT融合蛋白）。

引言

顶复门（Apicomplexa）原生动物包含多个具有重要医学和兽医学意义的专性细胞内病原体，如弓形虫、疟原虫、隐孢子虫、艾美耳球虫、巴贝虫和泰勒虫。理解寄生虫的代谢通路并将其应用于基因工程已彻底改变了顶复门生物学研究。这些遗传工具的核心是选择标记：即通过赋予表型，使转基因寄生虫能够从大量野生型或亲本寄生虫中被分离出来。选择标记通常通过引起药物抗性来补偿代谢营养缺陷，从而实现正选择或负选择。正选择通常涉及表达抗性基因，使得仅转化后的寄生虫能在原本致死的药物浓度下存活。相比之下，负选择利用蛋白质使寄生虫对替代底物或前药敏感，从而实现对保留该基因功能寄生虫的“自杀式”清除。针对顶复门寄生虫已开发出多种筛选系统，各具优势。尽管面临标记数量有限、特定药物存在宿主细胞毒性以及药物效力存在阶段或物种特异性差异等挑战，研究人员已建立起一套选择标记工具箱，支持对多种生物进行复杂的遗传学研究。本综述考察了顶复门中应用的药物筛选标记，重点关注其分子基础、机制及标记回收策略，并强调了最佳实践和常见误区，旨在指导学者有效理解和应用标记，同时展望新标记的开发前景。

顶复门中的选择标记

顶复门寄生虫中使用的选择标记可根据其作用机制进行分类。以下章节将讨论常见的选择标记，包括其潜在的生化通路和药物筛选机制。

嘧啶代谢

二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶（DHFR-TS）是一种双功能酶，参与胸苷酸（dTMP）合成和辅因子循环。抗叶酸药物（如乙胺嘧啶）靶向寄生虫DHFR-TS，阻断dTMP生成和DNA复制，这催生了首批顶复门选择标记之一：耐药性的DHFR-TS*等位基因。通过在恶性疟原虫自然耐药突变的启发下对刚地弓形虫（T. gondii）DHFR-TS引入点突变，创建了一种显性选择标记。表达DHFR-TS*的寄生虫能够在致死剂量的乙胺嘧啶培养环境中增殖。同样，在恶性疟原虫（P. falciparum）中，通过使用突变的人源DHFR（hDHFR）实现了稳定转染，该突变体对抗叶酸药物WR99210具有抗性。DHFR为基础的标记是基于生理必需的一碳通路的耐药性选择典范，对转基因突破至关重要，至今仍在寄生虫研究中广泛使用。

尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）将尿嘧啶转化为UMP。刚地弓形虫能够摄取宿主来源的尿嘧啶并天然表达UPRT，而其他许多顶复门寄生虫缺乏此酶。UPRT已被开发为负选择标记。其原理是UPRT将前药5-氟尿嘧啶（5-FU）或由FUDR裂解产生的5-FU转化为有毒的5-FUMP，从而杀死UPRT阳性寄生虫。FUDR是一种核苷前药，需要先转化为核苷碱基5-FU才能被UPRT作用。刚地弓形虫可以掺入5-FU/FUDR导致死亡，但UPRT缺陷突变体对这些药物具有抗性。在导入破坏UPRT的构建体后，可施用5-FU或FUDR选择性清除仍具有功能性UPRT的寄生虫，富集丢失该酶的寄生虫。值得注意的是，酵母胞嘧啶脱氨酶-UPRT融合蛋白（yFCU）已在恶性疟原虫中使用。隐孢子虫编码潜在的UPRT蛋白，但其功能和转基因应用尚未见报道。

许多顶复门寄生虫（如疟原虫属）可以通过二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）从头合成嘧啶，该过程依赖于线粒体电子传递链。阿托伐醌（Atovaquone）通过抑制细胞色素bc1杀死寄生虫，从而阻断DHODH活性并导致嘧啶饥饿。这一障碍通过使用酵母DHOD（yDHODH）酶得以克服，该酶使用富马酸盐作为电子受体，因此不依赖电子传递链。转基因寄生虫表达yDHODH后，即使原生DHODH被抑制，也能获得合成嘧啶的能力。因此，它们能在阿托伐醌或寄生虫特异性DHODH抑制剂处理下存活。实际上，携带yDHODH的恶性疟原虫菌株可通过阿托伐醌或DHODH抑制剂（DSM1或DSM265）进行筛选。这种正选择用来自其他生物体的药物不敏感等效物替换了必需的寄生虫酶。yDHODH已在恶性疟原虫中使用，偶尔与负选择结合以实现通过正负筛选进行基因敲除。

嘌呤代谢

顶复门寄生虫无法从头合成嘌呤，必须从宿主细胞中补救（嘌呤营养缺陷型）。次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）是嘌呤补救途径的关键酶，将次黄嘌呤、黄嘌呤或鸟嘌呤转化为各自的核苷酸（IMP、XMP、GMP）。HXGPRT筛选利用了这一补救通路。在刚地弓形虫中，首先生成缺失HXGPRT（Δhxgprt）的突变株，使寄生虫对霉酚酸（MPA）高度敏感，MPA抑制肌苷单磷酸脱氢酶（IMPDH）并耗尽鸟嘌呤核苷酸。这些Δhxgprt寄生虫除非提供通往GMP的替代途径，否则无法在MPA中存活。筛选是通过引入功能性HXGPRT并在培养基中补充MPA和黄嘌呤来实现的。表达HXGPRT蛋白的转基因寄生虫可以补救黄嘌呤产生XMP/GMP，绕过MPA阻断从而存活，而HXGPRT缺陷的寄生虫则死亡。该系统首先在刚地弓形虫中报道，MPA耐药的刚地弓形虫突变体获得了利用黄嘌呤的能力。随后对刚地弓形虫HXGPRT基因的功能表征表明，它可以在Δhxgprt寄生虫中作为选择标记。

HXGPRT筛选非常高效。只有HXGPRT⁺寄生虫能在含MPA和黄嘌呤的培养基中形成空斑，在1-2周内即可获得稳定转化子。它既可以作为正选择标记，也可以作为负选择标记。部署有毒的嘌呤类似物（6-硫代黄嘌呤或6-硫代鸟嘌呤）进行负选择；该酶将它们转化为致死核苷酸，杀死表达HXGPRT的寄生虫，而放过HXGPRT缺失的寄生虫。事实上，早期研究利用6-硫代黄嘌呤筛选刚地弓形虫Δhxgprt突变体，反之，利用MPA/黄嘌呤分离HXGPRT回补克隆。这些发现使得HXGPRT可用于刚地弓形虫的异位表达、基因敲除和标记回收。在恶性疟原虫中，HXGPRT对生存至关重要，因此无法生成hxgprt缺失株来应用相同的筛选方案。隐孢子虫缺乏HXGPRT基因，且由于寄生虫能够直接摄取宿主核苷酸，其嘌呤补救通路并非必需。因此，它仍然是仅适用于刚地弓形虫和新孢子虫（Neospora caninum）的专用标记，在这些物种中可以利用突变株和限定培养基来利用嘌呤营养缺陷型。

翻译抑制

顶复门寄生虫中的几种选择标记源自抗生素抗性基因，这些基因能使靶向蛋白质合成的药物失活。这些标记是显性的（在野生型背景下发挥作用），通常借用自细菌或真菌。一个挑战是抗生素通常也会伤害宿主细胞，因此需要优化。新霉素磷酸转移酶（又称氨基糖苷3-磷酸转移酶II，NEO或NPTII）通过磷酸化使氨基糖苷类抗生素失活，赋予对G418（遗传霉素）的强大抗性，G418在低浓度下会导致真核生物致死性的翻译错误。引入Neo^R基因使寄生虫能够解毒G418并在其存在下继续蛋白质合成。由于G418也会杀死宿主细胞，因此需要调整时机和剂量，以便转基因寄生虫在宿主细胞被破坏之前得以发育和传播。恶性疟原虫生长在成熟红细胞中，缺乏活跃的蛋白合成机制，因此宿主细胞可以耐受更高剂量的G418。NEO/NPTII筛选不依赖于任何寄生虫通路——它只是提供一种药物解毒酶，因此只要药物能到达寄生虫，就可以在任何顶复门寄生虫中发挥作用。

杀稻瘟素S脱氨酶（BSD）使抗生素杀稻瘟素S脱氨基，使其无毒。杀稻瘟素是肽键形成的抑制剂，在低浓度下即可杀死多种细胞。表达BSD的寄生虫能够在杀稻瘟素存在下存活，因为它们可以中和该药物。杀稻瘟素筛选往往严格且起效快。BSD和NEO靶向不同的抗生素，因此可以组合或序贯使用而互不干扰，实现多标记实验（如双重耐药的恶性疟原虫）。BSD不适合体内应用，因为它对动物具有高毒性，但在体外，它已成为疟原虫属、巴贝虫属和泰勒虫属常用的标记。氯霉素乙酰转移酶（CAT）使氯霉素乙酰化，阻止抗生素与核糖体结合。氯霉素是一种抑菌化合物，抑制顶质体（apicoplast）中类似原核生物的核糖体。刚地弓形虫对氯霉素敏感，由于细胞器功能丧失而非立即的细胞毒性，表现出“迟发性死亡”。异位表达CAT使寄生虫能够灭活氯霉素。通常需要延迟给药以平衡药物的缓慢但最终强烈的效果。CAT是最早在刚地弓形虫中部署的选择标记之一。

DNA损伤

博来霉素抗性蛋白（由Ble^R编码的BRP）提供对博来霉素家族抗生素的抗性。博来霉素及相关化合物腐草霉素（商品名Zeocin）诱导DNA双链断裂，杀死细胞。Ble蛋白隔离这些抗生素，防止DNA损伤。该系统已在刚地弓形虫中进行了改造，显示转染了ble基因的寄生虫能够在腐草霉素暴露下存活。一个实际的限制是宿主细胞毒性。腐草霉素会损伤宿主细胞的DNA，导致其在几天内死亡。因此，筛选寄生虫的时间窗口很窄——寄生虫必须在宿主单层细胞丢失之前复制并形成可见病灶。博来霉素筛选严苛但对刚地弓形虫的稳定整合有效。虽然在理论上有可能利用博来霉素抗性于恶性疟原虫，但尚未被广泛采用。大多数研究人员保留此标记，特别是当需要独立筛选时，因为作为基因毒性物质，它提供了与其他标记完全正交的优势。

物种特异性应用

选择标记的效用因顶复门生物的生物学特性、培养方法和药物可及性而异。不同寄生虫物种部署转基因标记的方式及物种特异性限制如下：

刚地弓形虫和新孢子虫

刚地弓形虫是第一个实现稳定遗传工程的顶复门寄生虫，因此拥有最成熟的转基因筛选工具箱。其最初的转化利用了代谢营养缺陷型：利用大肠杆菌的色氨酸合成酶（TrpB）来补偿寄生虫无法合成色氨酸的缺陷，在缺色氨酸培养基中筛选寄生虫。虽然色氨酸筛选（TrpB/吲哚）现在很少使用，但它证明了填补寄生虫营养缺口有助于进行遗传修饰。随后的刚地弓形虫标记主要是药物抗性基因。乙胺嘧啶耐药的DHFR-TS*突变体成为正选择的主流，只需向感染宿主细胞添加药物即可有效回收转基因速殖子。同样，通过生成Δhxgprt菌株开发了HXGPRT筛选，并使用MPA和黄嘌呤。它还可以作为负选择标记，利用6-硫代黄嘌呤回收原始标记或进行异位表达。

刚地弓形虫还利用显性标记BSD、CAT和BRP。CAT标记在1990年代初引入，促进了首批基因敲除和报告菌株的建立。筛选是在经药物处理的成纤维细胞单层上进行的。氯霉素筛选需要较长时间（10-14天），因为药物作用是迟发性的。某些抗生素（杀稻瘟素、腐草霉素）会损伤或杀死哺乳动物宿主细胞。研究人员开发了变通方法：例如，使用较低的初始剂量或延迟给药以让寄生虫抢占先机，或使用更健壮的宿主细胞。例如，在10 μg/mL杀稻瘟素浓度下一周内可形成空斑，但通常必须从较低剂量（5 μg/mL）开始，以免宿主细胞立即死亡。耐药寄生虫增殖旺盛，超过了宿主细胞较慢的死亡率。

刚地弓形虫的独特之处在于，上述任何标记均可在单一阶段（速殖子）使用，并且转基因寄生虫如有需要可通过小鼠传代。刚地弓形虫还受益于双重选择和标记回收。常用的RHΔhxgprt菌株允许分别使用HXGPRT（正选择）和UPRT（负选择）进行敲除和回补验证。此外，表达二聚化Cre重组酶（DiCre）的菌株能够实现基于loxP的切除。Floxed HXGPRT盒也可以通过负选择切除以回收标记。这些能力使刚地弓形虫成为遗传操作最便利的顶复门寄生虫。新孢子虫具有相似的生物学特性；因此，许多刚地弓形虫筛选系统已移植到该物种中。例如，创建了Δhxgprt新孢子虫菌株，并成功用刚地弓形虫HXGPRT回补以获得MPA/黄嘌呤抗性。此外，新孢子虫天然对乙胺嘧啶敏感，但在NcDHFR-TS发生突变后可获得抗性。它也已通过转染TgDHFR-TS*用于乙胺嘧啶筛选。一般来说，在弓形虫中有效的多数选择标记都很容易转移到新孢子虫中。

疟原虫属

恶性疟原虫作为人类疟疾病原体，给稳定转染带来了独特的挑战。它必须维持在无核且不分裂的人红细胞中。尽管如此，1990年代中期利用突变的人DHFR选择标记实现了恶性疟原虫的首次稳定转化。引入带有特定点突变的hDHFR赋予了对抗叶酸药物WR99210的抗性，使得能够在血液培养中筛选转基因寄生虫。这一突破提供了一个基线标记，至今仍在使用。基于乙胺嘧啶的标记在恶性疟原虫中效果较差；因此，WR99210与hDHFR配对提供了更优的筛选方案。使用约5 nM的这种高亲和力抑制剂数周，研究人员可以获得稳定的恶性疟原虫转基因株，其中几乎所有未转染的寄生虫都被清除，只有携带hDHFR标记的寄生虫存活下来。NEO和BSD作为独立选择标记在恶性疟原虫中的引入，极大地扩展了工具箱。G418筛选在约4-6周内产生耐药寄生虫，转染子显示出Neo^R的整合和表达。同样，杀稻瘟素S筛选数周后产生耐药寄生虫。携带hDHFR的寄生虫对G418和杀稻瘟素敏感，反之亦然，这为恶性疟原虫的多重遗传修饰提供了机会。除了BSD、NEO和hDHFR外，yDHODH和PAC（嘌呤霉素N-乙酰转移酶）也在恶性疟原虫中使用。

恶性疟原虫的转染通常通过将质粒DNA电穿孔到受感染的红细胞中完成，随后施加药物并维持数周。由于其无性周期持续约48小时，获得耐药寄生虫群体需要2-3周（对于起效快的药物如杀稻瘟素）至6-8周（对于较温和的药物如WR99210或G418）。寄生虫通常在定期更换培养基和补充新鲜红细胞的培养中维持，直到耐药虫血症上升到可检测水平。目前的筛选药物对红细胞均无活性。例如，G418可以被红细胞摄取，但由于红细胞缺乏蛋白质合成，其主要靶点是内部的寄生虫。杀稻瘟素对寄生虫迅速产生毒性，而人红细胞没有杀稻瘟素靶向的机制。其他标记包括yDHODH/阿托伐醌和yFCU/5-氟胞嘧啶（5-FC）。恶性疟原虫方案也使用多标记，包括正负筛选，例如通过双交换整合hDHFR，然后使用yFCU+5-FC。DiCre系统也常被部署。

啮齿类疟原虫（伯氏疟原虫P. berghei、约氏疟原虫P. yoelii、夏氏疟原虫P. chabaudi）和其他物种（诺氏疟原虫P. knowlesi）的基因工程也取得了进展，并适应了它们特定的生命周期。伯氏疟原虫的常用方法是电穿孔裂殖体阶段寄生虫，然后注射到小鼠体内并对感染小鼠施加药物压力。饮用水或饲料中的乙胺嘧啶可以选择携带突变DHFR-TS*的转基因伯氏疟原虫。经过小鼠体内一次或两次传播传代后获得稳定工程化的寄生虫。同样，hDHFR/WR99210筛选已在伯氏疟原虫中使用，但乙胺嘧啶因成本和给药便利性在啮齿类动物工作中更为实用。杀稻瘟素筛选已被证明可在小鼠感染前富集转基因伯氏疟原虫。此外，yFCU已在伯氏疟原虫中改造用于反筛选，类似于恶性疟原虫。其他物种如诺氏疟原虫（现已适应培养的一种猴疟原虫）已成功使用了恶性疟原虫的工具，例如hDHFR和BSD。转染方案的进步帮助建立了诺氏疟原虫在人红细胞中的连续培养转基因株。间日疟原虫（P. vivax，一种复发性疟疾）仍然难以培养，因此稳定转染尚未建立。总体趋势是，如果生命周期能够容纳药物筛选，核心标记可转移到其他疟原虫物种。

隐孢子虫属

隐孢子虫长期难以进行遗传修饰，原因是缺乏连续培养系统。刚地弓形虫的稳定转染通过NEO（Neo^R）标记、体内巴龙霉素（paromomycin）筛选和CRISPR/Cas9系统得以实现。巴龙霉素是一种氨基糖苷类药物，当给予感染小鼠时，能够筛选表达Neo^R的寄生虫。转基因隐孢子虫菌株是通过电穿孔将纳米荧光素酶（Nluc）-Neo^R和CRISPR-Cas9质粒导入子孢子，然后感染免疫抑制小鼠并在饮用水中供应巴龙霉素而产生的。Nluc-Neo^R筛选对巴龙霉素耐药的寄生虫，同时监测荧光素酶活性。由此产生的隐孢子虫携带Neo^R基因并显示修饰的等位基因。这是一项显著成就，证明了隐孢子虫可以被修饰。存在特殊的考量；由于寄生虫感染肠上皮，因此使用口服给药。巴龙霉素全身吸收不佳，这实际上是有利的；药物停留在肠腔对寄生虫施加压力，而不会引起宿主的严重毒性。通常，小鼠被免疫抑制（如IFN-γ基因敲除、SCID小鼠）以允许持续感染，并给予转基因寄生虫更好的竞争机会。最初效率低下；因此需要在药物压力下多次感染周期并通过流式细胞术分选以富集/分离稳定株系。

自开创性研究以来，越来越多的实验室已经生产出转基因隐孢子虫菌株，产生了大量涉及反向和/或正向遗传学的有趣发现。修饰不再低效，并且不总是需要流式细胞术来分离稳定的转基因株系。其转基因工具箱近年来发展迅速，包括新的选择标记，如突变的苯丙氨酰tRNA合成酶（PheRS），它提供对双环氮杂环丁烷BRD7929的抗性。另一个选择标记是赖氨酰tRNA合成酶（CpKRS），其中对DDD01510706耐药的突变CpKRS可用作选择标记。尚未报道抗叶酸标记（DHFR/乙胺嘧啶），因为隐孢子虫拥有一条旁路途径（胸苷激酶）来产生TMP，且寄生虫对乙胺嘧啶具有天然抗性。它也缺乏HXGPRT，且其IMPDH对MPA具有抗性，排除了在刚地弓形虫中部署的基于HXGPRT的负选择和正选择策略。然而，隐孢子虫编码具有UPRT活性的基因，包括一种高度特化的融合UK-UPRT酶，可被开发用于建立负选择。

艾美耳球虫属

艾美耳球虫属包含1800多个物种，其中一些感染家禽。挑战在于艾美耳球虫物种具有高度的宿主特异性，只能在体内繁殖（例如，E. tenella在鸡中；E. falciformis在小鼠中；E. neischulzi在大鼠中）。艾美耳球虫物种的稳定转染已通过改造弓形虫标记得以建立。子孢子被转染携带DHFR-TS的质粒，然后注射到供应含乙胺嘧啶饲料的动物中。纯化转基因卵囊后，已使用荧光分选辅助工作。通过收集卵囊并在药物压力下感染新动物，可以获得稳定修饰的株系。迄今为止，DHFR-TS表达联合乙胺嘧啶筛选仍然是最实用的方法，这有助于生成转基因E. tenella和E. nieschulzi株系。E. tenella拥有一个UPRT直系同源物；其功能尚待检验，但有可能用于负选择。与刚地弓形虫不同，没有方便的阶段来诱导Cre/lox切除。任何切除系统都必须在体内或离体触发，这很复杂。因此，目前的艾美耳球虫工作产生的寄生虫保留了选择标记。这对于疫苗开发是可以接受的，因为标记甚至可能作为遗传标签，但对于基础研究而言，去除标记是可取的。

最近的一项研究表明，突变的（F204S）肾上腺铁氧还蛋白氧化还原酶可以使用盐霉素作为选择标记。另一份报告显示了EtcPRS（脯氨酰-tRNA合成酶）被卤夫酮抑制，提供了利用耐药的EtcPRS*突变体（A1852G和A1854G）作为艾美耳球虫（和弓形虫）选择标记的机会。尽管取得了这些进展，艾美耳球虫物种的转染效率仍然很低，因此即使进行药物筛选，亲本株和转基因株的混合仍然是一个问题。通常只有一小部分卵囊携带转基因，需要通过动物多次传代富集转基因群体并进行克隆分离。

巴贝虫属和泰勒虫属

巴贝虫属和泰勒虫属是蜱传播的血液寄生虫（梨形虫），引起牲畜疾病。巴贝虫可以在红细胞中培养，而泰勒虫具有独特的存在于淋巴细胞中的裂殖体阶段（T. parva和T. annulata）或存在于红细胞中（T. equi）。这些生物的遗传进展借鉴了疟疾研究的工具。对于巴贝虫，已在牛巴贝虫（B. bovis）、双芽巴贝虫（B. bigemina）和吉氏巴贝虫（B. gibsoni）中实现了稳定转染。牛巴贝虫被转染编码hDHFR的质粒，并在数周的WR99210体外筛选下获得转基因寄生虫。该研究还报道了使用hDHFR/WR99210和BSD/杀稻瘟素的双重筛选策略，以强制整合两个转基因到牛巴贝虫中。巴贝虫中的“双重药物”方法类似于恶性疟原虫，强调了标记的跨物种应用。同样，在牛巴贝虫株中实现了GFP-BSD融合蛋白在牛红细胞培养中的表达。类似地，马泰勒虫（T. equi）转基因寄生虫是利用与GFP融合的BSD标记构建的。泰勒虫淋巴细胞中的裂殖体阶段构成了特殊挑战：可以将DNA导入受感染的淋巴母细胞并筛选那些哺乳动物细胞（例如用潮霉素），但尚未见稳定转基因生成的报道。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）或yFCU标记在概念上是可行的，但尚未在梨形虫寄生虫中使用。

标记回收与负选择

鉴于正选择标记的数量有限，研究人员开发了回收技术以重复用于连续的多次修饰。标记回收通常需要从