《Materials Today Bio》：Apical-out airway organoids as a pathophysiological model to study macrophage-mediated epithelial responses to microplastics
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研究人员构建了人气道基底干细胞（hABSCs）来源的顶向外气道类器官（AOAOs），其纤毛表面朝外，用于评估按操作尺寸分级的多分散聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）。PS-MPs经激光衍射、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、尼罗红标记、内毒素检测及培养基稳定性/蛋白吸
研究人员构建了人气道基底干细胞（hABSCs）来源的顶向外气道类器官（AOAOs），其纤毛表面朝外，用于评估按操作尺寸分级的多分散聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）。PS-MPs经激光衍射、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、尼罗红标记、内毒素检测及培养基稳定性/蛋白吸附实验表征。AOAOs在两种浸没式条件下暴露：直接将PS-MPs施加于类器官表面，或间接暴露于经PS-MPs处理的THP-1来源巨噬细胞的 conditioned media。CCK-8、MTT及LDH范围筛选实验确定1和100 μg/mL为非细胞毒性剂量用于巨噬细胞-类器官实验。直接暴露不同尺寸PS-MPs未显著诱导TNF-α表达、黏蛋白分泌、上皮屏障破坏或杯状细胞增生；而小尺寸PS-MPs与巨噬细胞结合最强，并诱导细胞外IL-1β释放。小尺寸100 μg/mL组选择性激活caspase-1，伴随cleaved GSDMD免疫反应性及LDC7559敏感的IL-1β释放，支持caspase-1相关、GSDMD敏感的部分IL-1β分泌机制，但未确立典型炎症小体激活。该AOAO平台为解析PS-MPs通过巨噬细胞条件介质诱导气道上皮重塑提供了浸没式机制概念验证，但不代表气溶胶沉积或吸入等效剂量学。
研究背景与意义
近年来，空气中微塑料（microplastics, MPs）对人体健康的潜在危害受到广泛关注。吸入性MPs被认为可引发炎症、氧化应激甚至组织损伤，但其与人呼吸道组织的相互作用机制仍缺乏可靠的人源体外模型。现有气-液界面（air–liquid interface, ALI）培养虽能模拟气道上皮与外部病原体的接触，但在高通量应用和可扩展性方面存在局限。传统基质胶嵌入的气道类器官多为顶向内结构，外部物质难以直接接触顶端上皮表面，限制了呼吸暴露相关研究。为此，研究人员开发了顶向外气道类器官（apical-out airway organoids, AOAOs），旨在区分微塑料直接作用于上皮与免疫细胞介导的可溶性因子信号两种机制。该研究发表于《Materials Today Bio》，为呼吸毒理学提供了新的机制研究平台。
主要技术方法
研究采用人气道基底干细胞（hABSCs）在超低吸附条件下无基质胶培养，形成顶向外结构的AOAOs，并通过免疫荧光验证纤毛细胞、杯状细胞和基底干细胞的分布。PS-MPs经低温研磨及筛分获得小、中、大三个操作尺寸组分，并进行理化表征。巨噬细胞由THP-1单核细胞经PMA诱导分化成M0型，并在部分实验中用LPS刺激为M1样表型。暴露实验分为直接（PS-MPs加入类器官培养基）和间接（类器官接受巨噬细胞上清）两种方式，结合CCK-8、LDH、ELISA、qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光及流式细胞术等方法检测细胞活性、炎症因子分泌、上皮屏障功能及细胞重塑情况。
研究结果
3.1 PS-MPs的表征
激光衍射显示小、中、大PS-MPs平均粒径分别为11.62 ± 11.99 μm、77.81 ± 13.09 μm和148.8 ± 51.26 μm，均为多分散体系。FT-IR证实加工未改变化学结构，SEM显示颗粒呈不规则棱角状。小尺寸颗粒在培养基中保持稳定，蛋白吸附实验和zeta电位变化表明颗粒表面性质在生物介质中未发生剧烈改变，内毒素检测排除污染物干扰。
3.2 AOAOs的表征
AOAOs在第21天成熟，外表面分布有长约7 μm的纤毛，基底细胞与杯状细胞位于内层。活/死染色显示类器官细胞活力良好，杯状细胞比例约6.2%，符合健康人支气管组织生理范围。
3.3 巨噬细胞对PS-MPs的炎症反应
小尺寸PS-MPs与巨噬细胞结合最强，并显著提升IL-1β分泌，而中、大尺寸颗粒未引起类似释放。qRT-PCR结果显示小尺寸颗粒诱导IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8转录上调。Caspase-1活性测定及cleaved GSDMD免疫荧光支持小尺寸PS-MPs在100 μg/mL时通过caspase-1相关、GSDMD敏感的机制促进IL-1β分泌，但未检测到典型的炎症小体全通路激活。
3.4 直接及间接暴露对AOAOs生理完整性的影响
直接暴露未导致PS-MPs进入类器官内部，也未显著改变上皮屏障通透性；间接暴露中，小尺寸PS-MPs条件培养基偶见上皮屏障渗透性增加，但无普遍现象。
3.5 巨噬细胞介导的杯状细胞增生及TNF-α升高
直接暴露未诱导Muc5ac表达或TNF-α升高，而间接暴露于小尺寸PS-MPs条件培养基显著增加杯状细胞比例及黏液分泌，TNF-α mRNA水平提升约3倍。M1样巨噬细胞上清对上皮炎症反应的刺激更强。
3.6 与传统ALI模型的比较
在ALI系统中，直接暴露PS-MPs更易诱导杯状细胞增生和TNF-α升高，与AOAOs结果相反，提示模型几何结构和暴露方式对实验结果有重要影响。
讨论与结论
研究结果表明，在浸没式条件下，PS-MPs对AOAOs的直接作用有限，而巨噬细胞分泌的炎症因子在上皮重塑中起主导作用。该AOAO平台可有效分离直接颗粒接触与免疫介导效应，适合机制研究，但不能替代吸入剂量学和气溶胶沉积模型。未来需结合ALI系统、原代气道巨噬细胞及更复杂的器官芯片模型，进一步验证其在真实呼吸暴露中的适用性。
结论翻译
研究人员发现，在浸没式条件下，不同尺寸的操作分级PS-MPs直接暴露不会显著诱导AOAOs的TNF-α表达或杯状细胞增生；而经小尺寸PS-MPs处理的巨噬细胞条件培养基可增加AOAOs的TNF-α表达及杯状细胞增生。该AOAO平台可作为浸没式机制研究工具，用于区分上皮细胞直接颗粒接触与巨噬细胞介导的间接暴露效应，但并非已验证的吸入或气溶胶沉积模型。未来需引入气溶胶/ALI输送、原代气道巨噬细胞及正交机制验证，才能将结果延伸至真实呼吸暴露场景。
