利用人源类器官建立并表征肠道衰老模型：关于上皮?间质转化的见解

《Journal of Cellular Physiology》：Modeling and Characterization of Intestinal Senescence Using Human Organoids: Insights Into the Epithelial to Mesenchymal Transition

肠道衰老是全身衰老及年龄相关疾病的重要因素；然而，由于缺乏稳健的实验模型，相关深入研究一直受到限制。本研究采用两种衰老诱导剂——丁酸盐（butyrate，一种内源性微生物代谢物）和顺铂（cisplatin，一种外源性化疗药物）——建立了人小肠类器官的细胞衰老模型。两种分子均可诱导衰老相关特征，包括p16^INK4a、CDKN1A、IL8和TNF表达升高，以及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增强。RNA测序（RNA-sequencing）显示，顺铂而非丁酸盐激活了p53信号通路，而二者均下调了多种与营养吸收和代谢相关的通路。这些模型表现出营养转运体表达降低、葡萄糖摄取减弱以及对维生素D反应性下降，从而重现了老化或受损肠组织的特征。在顺铂处理的类器官中，基于RNA测序分析可见上皮?间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）相关基因本体（GO）条目富集。进一步通过EMT标志基因表达证实，顺铂诱导的细胞衰老可触发EMT，而在抑制转化生长因子?β（transforming growth factor?β, TGF-β）信号通路——这一经典EMT诱导通路——后，上述变化减弱。值得注意的是，TGF-β信号抑制还可缓解衰老诱导的炎症和营养功能障碍，这提示EMT可能是预防肠道衰老的重要干预靶点。本研究建立的模型为解析与不同衰老诱导机制相关的肠道特异性衰老分子机制，以及开发预防年龄相关肠功能障碍的策略，提供了新的研究平台。

该文发表于《Journal of Cellular Physiology》，聚焦于人类肠道衰老缺乏可靠实验体系这一关键问题。肠上皮在营养吸收、屏障维持和免疫调节中具有核心作用，但健康人肠道随年龄增长而发生的分子与功能变化，长期受限于取材困难和模型不足而缺乏直接证据。既往研究多依赖肿瘤或炎症性肠病样本，难以准确刻画生理性或应激性肠道衰老过程。为解决这一问题，研究人员基于人小肠类器官构建了两种细胞衰老模型，分别模拟内源性微生物代谢应激与外源性药物损伤应激，并系统评估其对肠上皮功能、营养代谢和细胞命运转变的影响。

研究人员采用丁酸盐（butyrate）与顺铂（cisplatin）分别诱导人小肠类器官来源肠上皮细胞（intestinal epithelial cells, IECs）发生衰老，证实二者均可引发典型衰老表型，包括p16^INK4a、CDKN1A/p21、炎症因子IL8和TNF表达增加，以及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增强。进一步通过转录组分析发现，两类模型虽共享衰老和营养功能衰退表型，但分子机制并不相同：顺铂显著激活p53通路并诱导上皮?间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT），而丁酸盐未显示相同的EMT富集特征。更重要的是，抑制转化生长因子?β（transforming growth factor?β, TGF-β）信号可缓解顺铂所致EMT、炎症反应及营养转运障碍，提示EMT可能是肠道衰老的重要机制节点与干预靶点。整体而言，研究建立了具有较高生理相关性的人源肠道衰老模型，为解析年龄相关肠功能减退及开发预防策略提供了实验基础。

就主要技术方法而言，研究以东京大学Stem Cell Bank提供的人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs；TkDN4-M）分化建立人小肠类器官，并构建单层培养体系用于功能测定。研究采用qRT-PCR、酶联免疫吸附测定（ELISA）、SA-β-Gal染色及caspase-3/7活性检测评估衰老表型；通过RNA测序（RNA-seq）结合差异表达基因（DEG）分析、KEGG与基因本体（GO）富集分析解析分子通路；并用跨上皮电阻（TEER）、免疫荧光、[¹⁴C]-AMG摄取实验及维生素D反应性检测评价屏障、EMT和营养吸收功能，同时利用TGF-β受体与Smad3抑制剂进行机制验证。

以下结合论文结果部分各小标题进行解读。

3.1 Butyrate Induces Cellular Senescent Features in Organoid-Derived Small Intestinal Epithelial Cells
研究人员首先比较了短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）对类器官来源小肠上皮细胞的影响。结果显示，乙酸盐作用较弱，而丙酸盐与丁酸盐，尤其是丁酸盐，可随剂量增加而显著提高p16^INK4a表达，并增强IL8、TNF等衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）因子的表达。ELISA进一步证实丁酸盐上调p16和IL-8蛋白水平。SA-β-Gal染色阳性面积增加，说明细胞进入衰老状态。与此同时，caspase-3/7活性未出现显著增强，提示在该条件下丁酸盐主要诱导的是衰老而非明显凋亡。该部分通过基因、蛋白和染色多重证据证明，过量丁酸盐可在人小肠类器官来源上皮细胞中诱导衰老样改变。

3.2 Cisplatin Induces Cellular Senescence in Organoid-Derived IECs
在第二种模型中，研究人员使用顺铂处理类器官来源IECs。结果表明，顺铂同样显著提高p16^INK4a、CDKN1A、IL8和TNF的转录水平，并增加p16、p21和IL-8蛋白表达。SA-β-Gal阳性细胞明显增多，而caspase-3/7活性仍未显著升高，说明顺铂在该实验框架下主要诱导稳定的细胞衰老而非广泛细胞死亡。由此，研究建立了外源性损伤驱动的人小肠上皮衰老模型。

3.3 RNA-Sequencing Analysis Reveals Differentially Expressed Genes in Butyrate- and Cisplatin-Treated Small Intestinal Organoids
转录组学分析进一步揭示了两种衰老模型的共性与差异。顺铂处理后，上调差异表达基因主要富集于细胞衰老相关通路，尤其包括p53信号通路以及TNF、NF-kappa B等炎症通路，符合DNA损伤诱导衰老的经典机制。丁酸盐处理虽然也引发大量转录变化，但未表现出与顺铂相同的显著通路富集模式。值得注意的是，两种处理均显著下调了与营养代谢相关的通路，如代谢通路、碳代谢、药物代谢、维生素消化与吸收及PPAR信号通路。GO分析进一步显示，顺铂上调基因中除DNA损伤、增殖抑制和凋亡相关条目外，还富集于细胞外基质组织、细胞迁移和细胞黏附等EMT/纤维化相关生物过程及细胞骨架、细胞外基质等细胞组分条目；而丁酸盐组并未出现同样明显的EMT相关富集。该结果说明，不同诱导因子虽然都可导致肠上皮衰老，但其下游生物学后果存在显著分化。

3.4 Nutrient Absorption- and Metabolism-Related Gene Expression and Function are Decreased in Cisplatin-Treated Organoid-Derived IECs
基于RNA-seq结果，研究人员重点分析了顺铂对肠上皮营养功能的影响。顺铂剂量依赖性下调葡萄糖转运体SLC5A1、SLC5A4、SLC5A9，亦抑制肽和氨基酸转运相关基因SLC15A1、SLC16A10、SLC6A6的表达，同时降低脂质代谢相关APOB、线粒体生物发生调控因子PPARGC1A以及药物代谢酶CYP3A4的表达。功能上，[¹⁴C]-AMG摄取实验显示SGLT1依赖性葡萄糖摄取明显减弱；而活性维生素D（calcitriol）诱导的SLC30A10、CYP3A4和S100G表达在顺铂处理后显著受抑，说明维生素D反应性下降。论文同时指出，丁酸盐也可降低葡萄糖摄取和维生素D反应相关基因表达。由此可见，两类衰老模型均重现了老化或受损肠组织的核心特征，即营养吸收和代谢能力减退。

3.5 Epithelial to Mesenchymal Transition-Related Genes are Upregulated in Cisplatin-Treated IECs
针对顺铂组在GO分析中呈现的EMT信号，研究人员进一步进行了验证。顺铂可剂量依赖性升高ACTA2、CDH2和TGFB1表达，并使编码E-cadherin的CDH1呈下降趋势，提示细胞由上皮表型向间质表型转变。功能层面，跨上皮电阻（TEER）下降，表明屏障完整性受损；E-cadherin免疫荧光减弱、ZO-1紧密连接结构受扰乱，提示上皮黏附与连接网络遭到破坏；α-SMA蛋白升高则进一步支持间质化倾向。随后，研究人员采用TGF-β受体抑制剂SB431542、SB525334及Smad3抑制剂SIS3进行机制验证。结果显示，这些抑制剂可显著降低顺铂诱导的ACTA2和TGFB1表达，但对CDKN1A影响较小，说明EMT更可能位于部分衰老下游而非单纯决定衰老启动。更重要的是，抑制TGF-β信号还能减轻IL8、TNF及IL-8分泌，并部分恢复SLC5A1、SLC6A6和PPARGC1A表达，提示EMT不仅是形态转变过程，也参与炎症放大和营养功能障碍的形成。

讨论部分总结了该研究的理论价值与应用意义。研究人员指出，肠上皮细胞更新快、代谢活跃，因此一旦进入衰老状态，可能对机体营养吸收、屏障稳态和炎症调控产生显著影响。本研究所建立的人小肠类器官模型较传统细胞系更接近生理状态，因而能够更真实地反映人类肠道衰老。丁酸盐模型模拟了微生态失衡背景下的内源性应激，顺铂模型则代表化疗等外源性损伤，两者共同展示了衰老、炎症和营养功能下降，但在p53通路激活和EMT诱导方面存在机制差异。论文还强调，老年人营养不良与衰弱日益成为重要公共卫生问题，而该研究提示细胞衰老驱动的肠道营养功能下降可能是可干预环节。特别是，TGF-β依赖的EMT与炎症、屏障破坏和代谢功能障碍相互关联，使EMT成为潜在关键靶点。作者同时指出模型仍有局限，包括主要聚焦上皮细胞、偏向应激诱导衰老、缺乏长期衰老相关遗传与表观遗传背景，以及单层培养体系难以完全模拟肠上皮顶端?基底侧分区。

研究结论可译为：研究人员利用丁酸盐和顺铂建立了人肠道类器官细胞衰老模型，这些模型重现了肠道衰老的若干重要特征。更为关键的是，借助不同衰老诱导因素，研究鉴定出肠道衰老涉及的分子机制，包括营养代谢受损、屏障功能障碍以及上皮?间质转化（EMT）。这些模型还为筛选新型药物开发分子及膳食成分提供了有用平台，从而有望实现改善老年人营养吸收与代谢、预防年龄相关肠功能障碍的预防性和/或治疗性干预。