VI型分泌系统效应物装载的分子基础

《Nature Microbiology》：Molecular basis of type VI secretion system effector loading

　　

VI型分泌系统（Type VI secretion systems, T6SSs）是广泛分布于细菌中的纳米机器，可将效应物递送至原核和真核细胞中。效应物货物如何被招募并装载到由T6SS注射的、形成管道的Hcp环装配体中，其机制仍知之甚少。铜绿假单胞菌拥有四个T6SS，每个系统与一个不同的Hcp蛋白相关。研究人员利用冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy）解析了装载到铜绿假单胞菌H3-T6SS的Hcp3环中的Tce1货物的结构。研究表明，单个Tce1单体与两个六聚体Hcp3环不对称地相互作用，并被其包裹，与Hcp3盘内表面的关键残基结合。数据表明存在一个分步装载机制，即首先形成异源二聚体Hcp–货物复合物，随后环状结构在效应物周围封装。结构建模提示，具有抗真菌活性的第二个T6SS效应物Tce2与Hcp3存在相似的相互作用。研究人员提出，此机制能够将广谱的货物协调递送至靶细胞。

微生物之间的竞争已持续数十亿年，这驱动了众多策略的进化，以获取稀缺资源和消除竞争对手。VI型分泌系统（type VI secretion system, T6SS）是一种动态的细菌超分子机器，可将有毒效应物注射到靶细胞中。T6SS功能多样，靶向多种细胞类型，如真核细胞（包括巨噬细胞、上皮细胞和杯状细胞）或真菌，或原核生物如革兰氏阴性细菌。这台纳米机器如同装有毒箭的弩，关于其组装如何启动、结构如何延伸以及如何收缩以将效应物射入易感细胞已有广泛认知。T6SS的尖端是一个穿刺装置，即由PAAR和VgrG蛋白组成的刺突复合物。胞质可收缩的T6SS鞘的聚合和延伸是一个协调事件，在此过程中，Hcp蛋白的六聚体环首先与VgrG–PAAR刺突复合物的平坦基底相互作用，然后相互堆叠形成被鞘包裹的管状结构。鞘的快速收缩推动PAAR–VgrG–Hcp穿刺装置穿过细菌包膜进入靶细胞，同时递送效应物。

尽管在可视化T6SS装置结构和动态方面已取得许多进展，但对于理解招募和装载毒素/效应物至T6SS的机制仍存在空白。例如，少数效应物可通过称为MIX、RIX、PIX、WHIX或FIX的保守基序靶向T6SS，但它们在分子水平上如何发挥作用尚未被研究。一些效应物需要伴侣蛋白或接头蛋白（如Eag或Tap蛋白）的辅助，这可能有助于防止其在产生细胞细胞质中发生过早折叠。T6SS效应物装载已被提出通过效应物附着到PAAR–VgrG–Hcp复合物的某个组分上而发生。效应物可以是这些T6SS元件中任何一个的C端延伸（此时称为特异性效应物），或招募至其中之一并称为货物效应物。通常，效应物与VgrG（例如大肠杆菌Tle1）和PAAR（例如铜绿假单胞菌Tse6）的关联已有很好描述。VgrG和PAAR（分别为三聚体和单体）可在单个T6SS刺突复合物上装载最多四个效应物。相比之下，Hcp环在细长的T6SS鞘中存在超过100个拷贝，增加了该系统递送具有不同功能的效应物鸡尾酒的能力。通过Hcp进行T6SS装载可能产生一个对任何类型猎物细胞都高度有效的系统，但关于毒素或效应物如何被招募到Hcp上却知之甚少。有趣的是，Hcp被认为具有伴侣活性，可通过稳定小效应物（如铜绿假单胞菌Tse2）发挥作用。基于电子显微镜（EM）的低分辨率图像，表明Tse2位于Hcp六聚体环的腔内。

铜绿假单胞菌配备了四个T6SS，即H1-、H2-、H3-和H4-T6SS，每个系统分别与同源Hcp蛋白Hcp1、Hcp2、Hcp3和Hcp4相关。在之前的工作中，利用体内免疫沉淀实验，研究人员已鉴定出与其中几种Hcp蛋白相关的潜在货物效应物。在此基础上，本研究描述了两个与Hcp3结合的、T6SS递送的推定半胱氨酸蛋白酶效应物（Tce）蛋白：Tce1（PA0256）和Tce2（PA2372）。研究人员利用冷冻电子显微镜展示了Hcp–货物效应物复合物的高分辨率结构。分辨率为3.8 ?的Hcp3–Tce1结构揭示了Hcp3效应物识别的分子细节、导致复合物形成的分子事件及其化学计量排列。数据表明，首先形成1:1的Hcp3–Tce1异源复合物，随后Hcp亚基在效应物周围顺序寡聚化，直至形成填充了Tce1效应物的最终Hcp3六聚体环。研究证明，T6SS效应物的装载需要两个环才能完全嵌入Hcp管道中。这些发现引入了一个由Hcp细胞浓度驱动的T6SS效应物装载新概念。总之，该研究定义了一种独特的效应物装载机制，并建立了T6SS货物复合物如何被Hcp招募和装载的分子原理。这些见解可能为合理工程化装备了Hcp–货物复合物鸡尾酒的、用于人类和自然生态系统中微生物组生物控制的T6SS携带细菌提供了可能。

研究人员首先鉴定了与Hcp3相互作用的两个H3-T6SS效应物候选蛋白。通过AlphaFold3预测和序列比对分析，表明Tce1（PA0256）和Tce2（PA2372）具有推定的半胱氨酸蛋白酶结构域，并与艰难梭菌毒素TcdB的催化二联体空间位置对齐。亲和层析实验显示两者均能与Hcp3共纯化，其中Tce1表现出更强的相互作用。基于此，研究人员优先选择Tce1进行高分辨率冷冻电子显微镜结构解析。

冷冻电子显微镜分析显示两个Hcp3环完全包裹Tce1。从铜绿假单胞菌PAO1中克隆的hcp3和tce1基因在大肠杆菌BL21（DE3）中共表达，并通过亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）共纯化。纯化后的复合物通过负染电子显微镜评估，随后进行冷冻电子显微镜成像。最终地图达到3.8 ?的整体分辨率，局部分辨率在复合物上达到3.4 ?以下。密度图解析出Hcp3环和Tce1 C端的原子模型。结构显示，Hcp3单体由九条β链和一条α螺旋构成，单体间通过氢键相互作用形成同源六聚体环。仅Tce1的C端结构域（CTD，氨基酸110-310）在冷冻电子显微镜重构中被解析，其包含推定的半胱氨酸蛋白酶催化位点。数据强烈支持一个模型，即两个堆叠的Hcp3环完全包裹全长Tce1，其CTD和NTD分别位于一个环的腔内。

结构分析揭示了Tce1与Hcp3环内表面残基的相互作用细节。Tce1作为单体存在于Hcp3六聚体环内，其与每个原体的界面不同，导致Tce1不对称地定位于Hcp3腔内。关键相互作用残基形成氢键或盐桥，包括在多个原体中反复与Tce1形成接触的保守残基S29、S31、E56和T60。为验证结构，研究人员在Hcp3的G121和K123残基处引入了庞大的色氨酸（W）突变，造成空间位阻。凝胶过滤色谱分析显示，这些突变体不再与Tce1相互作用，从而验证了三维结构的正确性。结果表明，Hcp–效应物识别源于保守接触位点和效应物特异性相互作用的组合。

研究发现Hcp3以浓度依赖的方式顺序包裹Tce1。通过在不同蛋白浓度下纯化Hcp3WT，发现其在高浓度下以六聚体形式存在，在低浓度（0.1 mg/ml）下以单体形式存在。在低浓度下与Tce1共纯化时，Hcp3以非六聚体形式与Tce1相互作用，色谱图和蛋白质印迹分析均证实了1:1 Hcp3–Tce1复合物的存在。对原始冷冻电子显微镜数据集的重新分析，发现了对应于环组装中间阶段的2D分类，其中Tce1仅被部分包裹。这些结果支持一个模型：Hcp3环形成是一个顺序过程，Tce1最初与少量Hcp3单体结合，随后其余的环围绕效应物组装起来。

功能分析表明Tce1和Tce2是推定的半胱氨酸蛋白酶。基于实验获得的Hcp3–Tce1复合物和AlphaFold3预测，Tce2被预测也位于Hcp3环的腔内，并可能跨越两个堆叠的Hcp3环。两个效应物共享保守的催化二联体残基。在大肠杆菌中异源表达对细菌生长无显著影响。在酿酒酵母中表达时，Tce2损害酵母生长，而突变其推定的活性位点（C115S）可缓解此毒性，证实了其功能相关性。Tce1在酵母中未表现出可测量的毒性，可能与其不稳定性或延长的N端有关。研究还通过监测TssB3-sfGFP标记的鞘组装，确认Tce1和Tce2是真正的效应物而非H3-T6SS组装因子。

讨论部分总结，本研究揭示了铜绿假单胞菌Hcp3–Tce1复合物的冷冻电子显微镜结构，展示了Tce1如何被包裹在同源六聚体Hcp3环的腔内。关键发现是装载过程的顺序性：Tce1首先通过特定接触（如形成氢键和盐桥）与单体Hcp3相互作用，这种初始的1:1相互作用可以成核六聚体形成。随后，额外的Hcp3原体被招募并围绕效应物寡聚化，建立不对称相互作用，最终形成完全组装的、装载了效应物的Hcp3六聚体。Hcp3蛋白可能通过其保守的“热点”残基（如S29, S31, E56, T60）与不同效应物结合，同时效应物特异的表面化学决定了不对称结合的模式。此外，Hcp环的浓度依赖性组装表明，Hcp3及其货物的细胞内水平可能调控分泌能力复合物的形成，为T6SS功能增加了一层控制。Tce2被证实是一种具有抗真菌特性的半胱氨酸蛋白酶。研究还支持一个概念，即单个T6SS可以递送效应物鸡尾酒。总之，通过定义T6SS效应物装载的分子基础，并建立效应物识别、顺序环组装和浓度依赖性寡聚化之间的前所未有的联系，这项工作为理解细菌如何部署T6SS效应物以调节细胞间相互作用提供了框架。