《Translational Oncology》：Sotorasib combined with 3-methyladenine for the treatment of KRAS G12C-mutant pancreatic cancer and its underlying mechanisms
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胰腺癌是一种起病隐匿且进展迅速的胃肠道恶性肿瘤。由于治疗策略有限，其病死率仍然较高。KRAS基因是实体瘤中最常发生突变的基因之一，针对胰腺癌中KRAS突变开发药物是当前研究重点。索托拉西布（Sotorasib，AMG510）是首个获美国食品药品监督管理局（FD
胰腺癌是一种起病隐匿且进展迅速的胃肠道恶性肿瘤。由于治疗策略有限，其病死率仍然较高。KRAS基因是实体瘤中最常发生突变的基因之一，针对胰腺癌中KRAS突变开发药物是当前研究重点。索托拉西布（Sotorasib，AMG510）是首个获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床的KRAS G12C靶向小分子抑制剂，已在结直肠癌和非小细胞肺癌等肿瘤中显示出安全性和抗肿瘤活性。目前，关于AMG510在KRAS G12C突变型胰腺癌中的作用机制研究仍处于早期阶段。本研究旨在考察AMG510对KRAS G12C突变型胰腺癌细胞的作用，并初步探索其作用机制。AMG510通过诱导活性氧（ROS）积累、线粒体损伤、细胞周期阻滞及细胞凋亡，抑制KRAS G12C突变型胰腺癌的发生与进展。RNA测序（RNA-seq）显示，AMG510可在KRAS G12C突变型胰腺癌中触发具有细胞保护作用的自噬。AMG510与早期自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）联合处理后，可进一步抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。小鼠实验进一步证实了AMG510联合3-MA在体内的生物安全性与有效性。本研究结果表明，AMG510在体外和体内均对KRAS G12C突变型胰腺癌表现出良好的抗肿瘤活性，而AMG510与3-MA联合可能成为KRAS G12C突变型胰腺癌临床治疗的一种候选方案。
该文发表于《Translational Oncology》，聚焦KRAS G12C突变型胰腺癌这一罕见但具有明确分子分型意义的亚群，系统评估了索托拉西布（Sotorasib，AMG510）的抗肿瘤作用，并进一步探讨其与早期自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）联用的增效机制。研究背景在于，胰腺癌总体预后极差，现有治疗仍以细胞毒化疗为主，疗效有限且毒性显著。KRAS是胰腺导管腺癌中最核心的驱动基因之一，但长期以来由于其缺乏经典小分子结合口袋且对三磷酸鸟苷（GTP）具有高亲和力，被视为“不可成药”靶点。随着共价抑制剂的发展，KRAS G12C突变因其半胱氨酸残基可被特异性识别而成为可药物干预的明确靶点。尽管AMG510已在非小细胞肺癌和结直肠癌中显示临床活性，但其在胰腺癌中的作用机制仍不清楚，尤其是是否存在除经典KRAS下游抑制之外的应激与适应性反应，仍缺乏系统研究。因此，开展本研究具有明确的机制学与转化医学意义。
研究人员围绕KRAS G12C突变型胰腺癌细胞MiaPaCa-2展开体内外研究，并以同样携带KRAS G12C突变的H358细胞作为辅助验证模型，同时以KRAS G12D突变的PANC-1细胞验证药物特异性。结果表明，AMG510可显著抑制KRAS G12C突变细胞增殖，诱导G1/S期细胞周期阻滞，促进线粒体功能障碍、活性氧（ROS）累积和细胞凋亡；转录组分析进一步揭示，AMG510还能诱导早期自噬，而该自噬具有细胞保护作用。进一步使用3-MA抑制早期自噬后，AMG510的抑制增殖、抑制迁移和促凋亡作用均进一步增强。动物实验显示，AMG510单药及AMG510联合3-MA均能显著抑制皮下及原位肿瘤生长，且未见明显系统毒性。研究最终得出结论：AMG510对KRAS G12C突变型胰腺癌具有明确抗肿瘤活性，而联合早期自噬抑制可进一步增强疗效，提示靶向KRAS G12C与干预自噬可构成潜在联合治疗策略。
本研究主要采用以下关键技术方法：首先通过Sanger测序确认MiaPaCa-2、H358及PANC-1的KRAS突变状态；随后应用CCK-8、克隆形成、划痕实验、流式细胞术检测细胞活力、克隆形成、迁移、细胞周期与凋亡；采用JC-1和DCFH-DA分别评估线粒体膜电位（MMP）与ROS水平；通过RNA测序（RNA-seq）、基因集富集分析（GSEA）和GO分析筛选AMG510作用通路；联合蛋白质印迹、免疫荧光、透射电子显微镜（TEM）及mRFP-GFP-LC3双荧光系统评估自噬；体内采用MiaPaCa-2来源裸鼠皮下移植瘤和胰腺原位移植瘤模型，并进行免疫组织化学（IHC）、血常规及肝肾功能评估。
在研究结果方面，论文首先在“AMG510 inhibits the proliferation of KRAS G12C-mutant pancreatic cancer cells and induces cell cycle arrest”部分证明，研究人员通过Sanger测序确认MiaPaCa-2和H358均携带KRAS c.34G>T（p.G12C）突变，为药敏实验提供遗传学基础。CCK-8及克隆形成实验显示，AMG510对MiaPaCa-2和H358具有显著的剂量依赖性抑制作用，而对KRAS G12D突变的PANC-1细胞无明显抑制作用，提示其突变位点选择性。流式细胞术显示，AMG510使KRAS G12C突变细胞G1/S期比例升高、G2/M期比例下降，蛋白质印迹进一步证实CDK2、Cyclin E和Cyclin D3表达降低，说明其抗增殖作用与细胞周期阻滞密切相关。
在“AMG510 promotes apoptosis and induces mitochondrial dysfunction in KRAS G12C-mutant pancreatic cancer cells”部分，研究人员通过Annexin V-FITC/PI双染流式分析发现，AMG510可浓度依赖性提高MiaPaCa-2和H358细胞凋亡比例，而对PANC-1无显著促凋亡作用。蛋白质印迹显示cleaved PARP和Bax上调、Bcl-2下调。进一步通过JC-1检测发现，AMG510显著降低线粒体膜电位，提示线粒体去极化；DCFH-DA流式及共聚焦成像则显示ROS显著积累。由此可见，AMG510通过破坏线粒体稳态并诱发氧化应激，促进KRAS G12C突变胰腺癌细胞凋亡。
在“AMG510 effectively inhibits the proliferation of KRAS G12C-mutant pancreatic cancer cells in vivo”部分，研究人员分别建立裸鼠皮下移植瘤和胰腺原位移植瘤模型。两种模型中，AMG510均显著降低肿瘤体积和重量。IHC结果显示Ki-67下降，而LC3B和cleaved caspase-3升高，提示肿瘤增殖受抑且伴随自噬与凋亡激活。与此同时，体重监测、血常规、肝肾功能及主要器官苏木精-伊红（H&E）染色均未见明显异常，说明AMG510在体内具有较好的生物安全性。
在“AMG510 induces early autophagy in KRAS G12C-mutant pancreatic cancer cells”部分，研究人员利用RNA-seq发现，AMG510处理后差异表达基因除富集于细胞周期阻滞相关通路外，自噬相关基因也明显变化，GO分析显示“macroautophagy”显著富集。TEM观察到双层或多层膜自噬体明显增多，并包裹受损线粒体和内质网。蛋白质印迹显示LC3B-II/LC3B-I比值升高、p62下降，提示自噬活化。进一步联合晚期自噬抑制剂氯喹（CQ）后，LC3B-II/LC3B-I比值和p62进一步升高，说明AMG510主要促进自噬早期过程，而非阻断自噬流。与此同时，p-mTOR和总mTOR降低，Beclin-1升高，提示AMG510可能通过抑制mTOR并激活Beclin-1诱导早期自噬。
在“AMG510 induces early-stage autophagy in KRAS G12C-mutant cells without blocking autophagic flux”部分，免疫荧光结果显示AMG510显著增加LC3阳性斑点，提示自噬体积聚。mRFP-GFP-LC3双荧光系统进一步证明，AMG510处理后红色荧光增加、绿色荧光减少，说明自噬体形成增加且能顺利与溶酶体融合；AMG510与CQ联用时黄色斑点进一步增多，进一步支持AMG510增强的是早期自噬形成而非阻断整体自噬流。
在“The role of autophagy in AMG510-induced cell death in pancreatic cancer cells harboring the KRAS G12C mutation”部分，研究人员使用早期自噬抑制剂3-MA进行功能干预。蛋白质印迹证实，3-MA可抑制AMG510诱导的LC3B-II/LC3B-I升高并阻止p62降解。功能实验显示，与AMG510单药相比，AMG510联合3-MA进一步降低MiaPaCa-2和H358细胞活力，显著减少克隆形成，进一步抑制划痕愈合，并明显提高凋亡比例。由此证明，AMG510诱导的自噬在KRAS G12C突变型胰腺癌细胞中主要发挥细胞保护作用，抑制该过程可增强药物致死效应。
在“AMG510 combined with 3-MA further suppresses the growth of KRAS G12C-mutant pancreatic cancer cells in vivo”部分，研究人员在裸鼠皮下移植瘤模型中比较了对照组、AMG510组、3-MA组及联合组。结果显示，AMG510可显著抑瘤，而联合3-MA后肿瘤体积和重量进一步下降。体重无显著变化，提示联合方案耐受性良好。IHC显示，与AMG510单药相比，联合治疗抑制LC3B表达，并进一步降低Ki-67、升高cleaved caspase-3，表明自噬受抑同时肿瘤增殖进一步受限、凋亡进一步增强。对肿瘤组织DNA与cDNA的Sanger测序显示，KRAS G12C突变在各组中持续存在，说明药物并不改变突变本身，而是通过抑制突变KRAS蛋白功能及其下游生物学效应发挥作用。
讨论部分指出，AMG510作为KRAS G12C共价抑制剂，为KRAS靶向治疗提供了关键突破，而本研究将这一策略拓展至胰腺癌领域，证明其在KRAS G12C突变型胰腺癌中同样具有明确活性。研究人员认为，AMG510一方面通过诱导细胞周期阻滞、线粒体损伤、ROS积累和细胞凋亡直接抑制肿瘤细胞，另一方面又激活早期保护性自噬，后者可能构成细胞适应药物应激的机制，从而限制单药疗效。3-MA与AMG510联用后，不仅总体凋亡增强，而且晚期凋亡比例升高，提示联合策略可能加速细胞由可逆性损伤向不可逆死亡转化。论文同时指出，原位模型中药效弱于皮下模型，提示胰腺癌特有的纤维化基质、低血管密度和免疫抑制微环境可能影响药物渗透与疗效。研究也坦陈若干局限，包括细胞模型数量有限、缺乏临床样本或类器官验证、AMG510诱导早期自噬的分子机制尚未完全阐明，以及KRAS G12C患者总体数量较少限制了临床验证规模。
研究结论部分可译为：总之，本研究不仅证实了AMG510在KRAS G12C突变型胰腺癌中的特异性抗肿瘤活性，而且首次揭示AMG510可通过诱导自噬来调控细胞应激反应与生存。自噬在AMG510活性中发挥关键调节作用，而联合早期自噬抑制剂3-MA可显著增强其治疗效果，提示靶向自噬具有协同治疗潜力。未来研究应结合肿瘤微环境特征，进一步阐明KRAS G12C通路与自噬之间的相互作用，以探索更具转化前景的联合干预策略。
